臍血CD34細胞向內皮細胞誘導分化的體外研究

張 臣，李 彤，侯躍龍，嚴曉曄，朱爭艷，高英堂，孫淑梅

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市第三中心醫院，天津市人工細胞重點實驗室）

大量胚胎學研究發現血管的形成來源于卵黃囊血島中成簇的干細胞,血島中間的細胞分化為造血干細胞而周圍的細胞分化為血管母細胞[1]。他們具有多種相同抗原表達,包括CD34、VEGFR-2、Tie-2等[2-4]，因而說明造血干/祖細胞和血管母細胞來自同一原始細胞。CD34作為富集造血干/祖細胞的主要標記，也表達于胚胎早期血管上，故可用于富集血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）[5]。與成人外周血干細胞相比，臍血（human umbilical cord blood，HUCB）干細胞具有顯著的增殖優勢，流式細胞儀分析顯示HUCB包含更多量CD34+單個核細胞[6]。因此本研究用臍血作為干細胞來源，建立CD34+細胞誘導分化為內皮細胞的方法，為今后治療缺血性心肌病，以及合成人工生物血管提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子-2(bFGF-2)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)(Pepro Tech,USA)，M199培養基和胎牛血清FBS(Gibico,USA),免疫磁珠分選系統和CD34抗體(Miltenyi Biotec,Germany)，人纖維連接蛋白(BD Bio sciences,USA)，FITC-CD31抗體(晶美生物公司，中國），PE-CD144抗體（VE-cadherin）（eBiosciences，USA），vWF抗體（Abcam,England），Dil-AcLDL（Molecular Probes,USA）。EPICS ALTRA流式細胞儀（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 兩部法與免疫磁珠分選CD34+細胞 收集健康產婦剖宮產后的臍血、臍帶（產婦知情同意），1∶5（HES∶HUCB）加入6.0%的羥乙基淀粉（HES），收集上層富含有核細胞的血漿，加至淋巴細胞分離液的液面上，離心吸取中間的白膜層，制備單個核細胞懸液。按MACS試劑盒說明書分選出CD34+細胞。

1.2.2 細胞誘導分化 將分離CD34+細胞1×105～ 3×105/cm2接種于人纖連蛋白包被的12孔板，每孔加入M199培養液（20%FBS、VEGF 50μg/L、b-FGF 1μg/L、IGF-12μg/L、維生素C 50μg/L、L-谷氨酰胺20mm/L），37℃、5%CO2溫箱里培養。

1.2.3 誘導后內皮細胞的鑒定 培養14d后，貼壁的細胞用胰酶消化，1×105細胞重懸于EP管中，加入CD144、CD31、CD45、CD34單克隆抗體，陰性對照管不加一抗，避光孵育30min，1%多聚甲醛固定，流式鑒定。vWF抗體在用Trition-X100破細胞膜后加入，余步驟同上。

1.2.4 細胞功能檢測 培養14d貼壁細胞加入Dil-AcLDL,避光孵育24h。熒光顯微鏡下觀察細胞攝取Dil-AcLDL的情況。

1.2.5 人臍帶靜脈內皮細胞的分離培養 取臍帶夾閉一端臍靜脈，另一端注入胰酶，孵育10min。收集細胞，接種于培養瓶中，37℃培養。傳1～3代，備用。1.3統計學處理 數據描述為均值±標準差，數據用SPSS 13.0統計軟件分析。

2 結果

2.1 臍血CD34+細胞的純化 本實驗處理的20份新鮮的臍血標本中，采集體積為（105.67±16.12）ml，經兩部法分離得到的單個核細胞為（2.7±2.3）×108/ml，經過MACS分離和純化，每份臍血標本能獲得CD34+細胞為（1.02±1.10）×105。剛分選后CD34流式檢測純度為（95.02±3.82）%（圖1A、1B）。

圖1 臍血CD34+細胞的純化

2.2 顯微鏡下觀察細胞形態 分離得CD34+細胞呈小圓形懸浮于培養液中，3d可觀察到明顯的細胞集落形成以及梭形貼壁細胞，7～14d出現多個細胞團，同時有貼壁的梭條形細胞從細胞團的邊緣以出芽方式長出，中間的細胞為圓形細胞，這種結構類似于血島。16d后梭形細胞逐漸增多，貼壁細胞形成鋪路石樣改變（圖2A～2C）。

2.3 內皮細胞表型及功能鑒定 培養14d后貼壁細胞中，約（78.32±7.56）%表達CD31，（14.35±8.64）%細胞表達CD34，vWF和CD144分別為（57.58±4.67）%和（69.67±3.12）%，而CD45表達陰性，這與成熟臍靜脈內皮細胞特異性表達相近（圖3）。用Dil-A－ cLDL與培養細胞共孵育后，在熒光顯微鏡下觀察，發現貼壁細胞中胞漿呈現紅色熒光，而胞核不顯色。證明細胞均攝取Dil-AcLDL（紅色熒光標記蛋白)，提示誘導分化出的貼壁細胞為有功能活性的內皮細胞（圖2D）。

圖2 鏡下CD34+細胞形態變化及功能鑒定

圖3 CD34+細胞培養14d后內皮細胞表型鑒定及相關比較

3 討論

近年來發現，循環血中存在內皮祖細胞，其具有分化為內皮細胞的能力，且移植到缺血動物模型中，可以整合為新生的血管[7-9]。目前有3種類型的臨床條件可受益于內皮祖細胞的移植：下肢缺血，心肌缺血以及疤痕后心臟病發作[10]。因此獲取內皮祖細胞，誘導分化后移植到缺血部位將作為治療性血管重建的來源之一。

筆者從臍血中分離CD34細胞，并成功誘導分化成內皮細胞，證明臍血中存在內皮祖細胞，它可以作為產生內皮細胞的來源。實驗中我們應用6.0%羥乙基淀粉和人淋巴細胞分離液兩步法分離的單個核細胞，這樣不僅減少細胞分離液的用量，且獲得單個核細胞數量多、混入的紅細胞數目少。進行磁珠分選時，不易發生因紅細胞多而堵塞磁珠的現象，使得最終獲得CD34+細胞數量多、純度高。在CD34+細胞誘導分化過程中我們認為細胞接種密度極其重要，當接種密度過低時細胞增殖和分化能力消失且長期培養不易成活。在接種密度大于1×105/cm2時,內皮細胞能夠增殖和分化。說明內皮祖細胞在生長過程中，細胞間相互作用對細胞的存活和增殖十分重要。其次我們發現細胞因子尤其是VEGF在CD34+細胞向內皮細胞誘導分化中也起著十分重要的作用，在缺少誘導因子培養相同天數的CD34+細胞，其內皮細胞特異性標志表達率低（圖3A）。CD34+細胞在長時間培養中易發生細胞碎裂壞死現象，我們認為可能是因其抗氧化能力弱，在加入適量維生素C后其長時間存活能力增強。培養過程中CD34+細胞可以成簇生長形成“細胞團”，其外周細胞表現出較高的增殖能力，分化的細胞向四周擴散生長，這類似于胚胎血島中原始血管形成過程。

綜上，臍血來源的CD34+細胞作為血管內皮的一種原始祖細胞,既可移植后形成毛細血管網為缺血組織提供血運，治療缺血性疾病；又可直接分化為血管內皮細胞促進人造血管內皮化，從而提高人造血管血液相容性和遠期通暢率；形成的內皮細胞也為體外研究藥物對血管內皮細胞的作用機制以及研究心血管疾病的發生機制特別是在研究動脈粥樣硬化發生的始動因素和分子機制提供了可靠的細胞模型。

［1］ Ka?meyer S,Plendl J,Custodis P，et al.New insights in vascular development:vasculogenesis and endothelial progenitor cells[J]. Anat Histol Embryol,2009,38(2):1

［2］ Kayisli UA,Cayli S,Seval Y,et al.LinksSpatial and temporal distribution of Tie-1and Tie-2during very early development of the human placenta[J].Placenta,2006,27(6):648

［3］ Hirashima M,Kataoka H,Nishikawa S.Maturation of embryonic stem cell into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis[J].Blood,1999,93(6):1253

［4］ Saha MS,Cox EA,Sipe CW,et al.Mechanisms regulating the origins of the vertebrate vascular system[J].J Cell Biochem,2004,93(3):46

［5］ Fan CL,Li Y,Gao PJ,et al.Differentiation of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood CD34+cells in vitro[J].Acta Pharmacol Sin,2003,24(3):212

［6］ Murohara T,Ikeda H,Duan J,et al.Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,2000,105(11):1527

［7］ Ingram DA,Mead LE,Moore DB,et al.Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells[J].Blood,2005,105(9): 2783

［8］ MoioliEK,ClarkPA,ChenM,etal.Synergisticactions of hematopoietic and mesenchymal Stem/Progenitor cells in vascularizing bioengineeredtissues[J].PLoSONE,2008,3(12):3922

［9］ Ott I,Keller V,Knoedler M,et al.Endothelial-like cells expanded from CD34+blood cells improve left ventricular function after experimental myocardial infarction[J].FASEB,2005,1096(6):3204

［10］Iwami Y,Masuda H,Asahara T.Endothelial progenitor cells:past, state of the art and future[J].J Cell Mol Med,2004,8(4):488