機械刮取法體外培養牛胸主動脈內皮細胞

譚培藝，高衛真，康 毅，焦建杰，婁建石，劉艷霞

（天津醫科大學藥理學教研室，天津 300070）

血管內皮細胞是位于血管內膜表面的單層扁平細胞，通過產生和分泌許多血管活性物質，在維持血管舒縮、抗凝血及血管構建等方面起重要作用。內皮細胞的體外培養是研究內皮細胞生物學與多種疾病關系的重要方法。牛胸主動脈來源充足、取材經濟、操作方便，已成為血管內皮細胞培養的主要材料。以往采用酶消化法[1]分離，消化時間不好把握，步驟冗繁，且容易污染。本實驗擬采用機械刮取法分離牛胸主動脈內皮細胞（CTAECs），旨在建立簡單、經濟、重復性強，適用于大規模實驗研究的細胞培養方法，為血管內皮細胞功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 屠宰場檢疫合格的成年黃牛，雌雄不限。

1.1.2 試劑 南美胎牛血清購自美國Hyclone公司。DMEM（含葡萄糖5.5mmol/L）液體培養基購自北京天潤善達生物科技有限公司。0.25%胰酶-EDTA購自美國Gibco公司。兔抗牛Ⅷ因子抗體及FITC標記的羊抗兔抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CTAECs的分離 剛剛宰殺的成年黃牛，上端從主動脈弓端，下端至膈的主動脈裂孔處，完整分離胸主動脈，用含有慶大霉素（8萬U/L）的PBS液4℃無菌保存，6~8 h內可用。操作前將主動脈血管置于消毒托盤中，剪去主動脈外膜附著脂肪，用上述PBS液沖洗3次去除血污后迅速移入超凈工作臺，縱向剪開血管，將其截成長約8 cm的組織塊，分塊置于培養皿中，再次用PBS液清洗。用無菌手術刀在每個組織塊內表面輕輕刮取若干次，后移入事先裝有DMEM完全培養液（含20%胎牛血清，葡萄糖 5.5mmol/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100mg/ml）的培養瓶中。注意刀片在培養液中輕晃幾次，使刮取下的細胞與培養液均勻混合。采用“力度梯度標記”法探索刮取力度，第一次獲取細胞的過程中，按照刮取力度不同在培養瓶上標記1~10，數字越大力度越大，接種完畢，取1滴細胞懸液在血細胞計數板上進行細胞計數，根據每瓶細胞成活率的不同探索最佳刮取力度，在此后的實驗中便可進行批量操作。最后將培養瓶置于37℃，5%CO2的培養箱中進行培養。24 h后更換培養液，去除未貼壁細胞。以后每3 d換液1次，至細胞融合鋪滿瓶底。

1.2.2 CTAECs的純化 若培養瓶中見有內皮細胞和平滑肌細胞同時貼壁生長，需對內皮細胞進行純化，方法如下：倒置相差顯微鏡（Olympus CK40-F200）下確定平滑肌細胞團的準確位置，標記于瓶底。倒掉瓶內培養液，將尖頭吸管探入瓶內，以標記處為中心貼瓶底螺旋形旋轉，破壞平滑肌細胞團，PBS液沖洗脫落細胞3次。重新注入DMEM完全培養液，置于37℃，5%CO2的培養箱中繼續培養。

1.2.3 CTAECs的傳代培養 待細胞生長融合達80%以上時可進行傳代。棄去瓶內培養液，PBS液清洗細胞3次，加入0.25%胰酶-EDTA混合消化液鋪滿瓶底,置于37℃，5%CO2的培養箱中孵育約7min，倒置相差顯微鏡下觀察細胞回縮變圓，開始漂浮移動時加入含血清DMEM完全培養液4~6ml終止消化，用尖頭吸管吹打制成細胞懸液。將瓶內培養液收集于離心管內，1 000 r/min，離心5min，棄上清。再重新注入DMEM完全培養液6~10ml，尖頭吸管吹打制成細胞懸液，按1∶2或1∶3比例將細胞懸液接種于培養瓶中，補足培養液，置于培養箱中培養。將細胞接種于24孔細胞培養板中，逐日細胞計數，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 CTAECs的鑒定 （1）形態學鑒定：利用倒置相差顯微鏡對原代和傳代血管內皮細胞進行常規觀察。（2）Ⅷ因子間接免疫熒光檢測：將培養在蓋玻片上的內皮細胞及對照組血管平滑肌細胞用95%乙醇，5%乙酸固定15min后滴加入兔抗牛第Ⅷ因子抗原診斷血清37℃孵育1 h，或4℃過夜。PBS沖洗，吸干后加FITC標記的羊抗兔IgG血清，37℃孵育30min。PBS沖洗，吸干后滴加9∶1的純甘油-PBS封片。熒光顯微鏡檢查，內皮細胞可見細胞核周呈黃綠色發亮熒光環。而平滑肌細胞無此熒光環，是為陰性反應。

2 結果

2.1 CTAECs生長曲線 1~3 d細胞數量逐漸增多，4~6 d進入穩定生長期，7~9d進入生長平臺期（圖1）。

2.2 牛胸主動脈內皮細胞的形態學觀察 倒置相差顯微鏡下，牛胸主動脈內皮細胞呈多角形、短梭形，核仁顯著，呈圓形或橢圓形。在接種24 h后貼壁生長，2~3 d有細胞從組織塊鉆出（圖2），10 d左右細胞融合成單層，如“鋪路石”樣鑲嵌排列（圖3）。傳代細胞生長旺盛，有時可見多核細胞。臺盼藍排除實驗證實，活細胞的百分比為93.7%。

2.3 Ⅷ因子相關抗原免疫組化鑒定 牛胸主動脈內皮細胞Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色可見細胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內可見黃綠色顆粒，核周密集（圖4）。證明培養的細胞為內皮細胞。

3 討論

內皮細胞形成機體內一個龐大的內分泌組織，其特殊的解剖學部位使內皮細胞能敏感的感知血流、壓力、炎癥信號以及血液循環中激素水平的變化，通過一系列信號傳導過程與鄰近及遠處的細胞相互聯系，對各種應激作出反應，維持機體內外環境的穩定。牛胸主動脈血管取材方便，來源豐富，與人體動脈血管非常相似，并且內表面積大，較人臍靜脈可操作性強，是建立內皮細胞體外培養模型的良好材料。

在培養細胞的獲取上，現主要有機械法[2]和酶消化法。酶消化法是利用酶液對內皮表面進行消化，收集消化液經離心棄上清等操作獲取細胞[3]，此法消化時間不好掌握，步驟冗繁，容易污染。胰蛋白酶消化能力不強,且有細胞毒性；膠原酶雖消化效果好，但價格昂貴，不適合實驗室批量應用。本研究經大量實驗證明，改良后的機械刮取法，克服了以往刮取法中細胞純度不夠以及酶消化法冗繁昂貴的缺點，是一個行之有效的內皮細胞體外培養方法。刮取法的力度選擇是一個難點，刮取力度不夠獲取的細胞太少，刮取力度過大又會導致平滑肌細胞的混入，因此我們采用“力度梯度標記法”探索刮取力度。第一次獲取細胞的過程中，按照刮取力度由輕到重可在培養瓶上標記1~10，數字越大力度越強。或者將探索時的刮取力度分為輕、中、重3個水平，分別標記于細胞培養瓶上，根據每瓶細胞成活率的情況探索出最佳的刮取力度，在此后的實驗中便可以此力度作為標準，進行批量操作。每次原代培養可制備10瓶左右細胞，熟練操作后，成活率可達60%以上。實驗證明，探索合適刮取力度后，內皮細胞的純度可達90%，把操作步驟簡單化，細胞成活率最大化，大大降低污染概率，使內皮細胞體外批量培養成為可能。但刮取法不可避免偶會混入平滑肌細胞，若發現培養瓶內混有平滑肌細胞團，可在倒置相差顯微鏡下找到細胞團，用記號筆在瓶身處標記其準確位置，待倒掉瓶內培養液后，將無菌尖頭吸管探入瓶內相應位置，以標記點為中心進行螺旋形涂抹，PBS液沖洗3遍去除脫落細胞，重新注入DMEM完全培養液繼續培養。此法可有效去除雜細胞，瓶內內皮細胞生長不受影響。

培養液的配置是CTAECs體外培養成功的另一個關鍵所在[4]。首先，培養基含糖量要求為5.5mmol/L，高低濃度的葡萄糖含量都可以抑制血管內皮細胞的增殖[5]，使細胞出現空泡等不良狀態，降低CTAECs的成活率。其次，有實驗結果顯示，高質量的血清對內皮細胞的生長有良好的促進作用，我們在實驗中選用南美血源的胎牛血清，占培養液20%的比例進行培養，極大促進了原代細胞的貼壁和傳代細胞的成活率，在不添加內皮細胞生長因子（VEGF）的情況下，可傳7~10代，細胞生長狀況良好。傳代后細胞增殖速度明顯加快，此時可將血清比例降為10%對增殖速度進行控制。最后，正確選擇傳代時機，可提高內皮細胞的成活率，傳代過遲造成細胞凋亡；傳代過頻，引起細胞變異和損傷[6]。

標本材料的新鮮程度也影響獲得內皮細胞的數量。有研究表明，動脈血管離體后，隨著時間的延長，細胞內一些物質的含量會發生變化。如離體超過6 h，內皮細胞Ⅷ因子相關抗原釋放量以及前列環素生長量均隨著存放時間的延長而下降[7]。本實驗于1 h內完成原代分離培養，細胞數量多增殖速度快。

牛胸主動脈內皮細胞相對于其他血管內皮易分離取得，經濟實用。應用改良后的機械刮取法可成功獲得大量牛胸主動脈內皮細胞，為體外研究建立血管內皮提供實驗模型，為進一步研究血管內皮的生物學特性及其與各種疾病的關系打下基礎。

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