不同持續時間有氧運動對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮依賴性舒張功能的影響

周 亮 申偉華 唐 暉

（湖南科技大學體育學院，湖南湘潭411201）

動脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS）是危害人類健康的一種常見老年疾病。研究表明，有氧運動是改善心血管健康，預防和輔助治療動脈粥樣硬化的有效手段。已知運動改善心血管健康與促進血管內皮細胞的NO釋放、改善血管內皮依賴性舒張功能有關，但是不明確何種強度和多長時間的運動為最適宜刺激。血管內皮依賴性舒張功能主要受NO和ET兩種信號分子的調節，NO為內皮細胞釋放的舒張血管物質，而ET是已知的最為有效的收縮血管的物質。內皮細胞的NO釋放受一些因素的調節，其中NOS是NO合成的關鍵限速酶，L-Arg可以有效促進NO釋放，但是L-Arg的競爭抑制物ADMA卻抑制內皮的NO釋放。關于不同運動持續時間對血管內皮依賴性舒張功能的影響鮮見報道，本研究試圖探索不同運動時間對內皮NO釋放量和一些調節內皮NO釋放的因素的影響，為運動抗動脈粥樣硬化提供實驗支持并探索合適的運動時間。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象

雄性SD大鼠60只，9周齡，體重250±10g，為II級實驗動物，購于中南大學醫學部實驗動物學部。室溫20～24℃，自然光照，自由飲食、飲水，每籠5只飼養1周后用于實驗。

1.2 動物模型的建立

依照參考文獻，給予AS、ASL、ASM和ASH組高脂飼料，高脂飼料配方:大鼠標準飼料中加1%膽固醇，0.35%膽酸鈉，5%豬油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前三天按70萬IU/kg的總劑量分三次灌胃給予維生素D3。動物建模時間為6周，6周后進行動物模型檢驗。

1.3 動物分組

于動物模型建立實驗前，隨機選取10只為對照組，未進行動物建模。建模成功大鼠隨機分為五組，C組 （正常對照組）、AS組 （動脈粥樣硬化模型組）、ASS組 （動脈粥樣硬化+30 min有氧運動）、ASM組 （動脈粥樣硬化+60 min有氧運動）、ASL（動脈粥樣硬化+90 min有氧運動），每組各10只。

1.4 有氧訓練安排

以上動物分組后進行三天的跑臺訓練，然后進行正式運動實驗。根據參考文獻和本實驗室的前期成果，大鼠跑臺運動強度跑速為20 m/min。三個運動組的運動時間分別設計為30 min、60 min、和90 min。實驗持續時間為4周，每周訓練6天，每天一次訓練。

1.5 測試方法

1.5.1 動物模型檢驗

動物模型建立為6周時間，建模后每組取3只處死，提取主動脈環，主動脈切片常規HE染色，光鏡下觀察檢驗模型建立是否成功。

1.5.2 動物取材

訓練結束后即刻用戊巴比妥鈉腹腔麻醉、宰殺，腹主動脈取血。血液提取后靜置30 min，3000轉離心10 min，分離血清，-80超低溫冰箱保存，供實驗分析。

1.5.3 NO和NOS測定

NO和NOS的測定均采用購自南京建成生物研究所的試劑盒測定，NO測定采用硝酸還原酶法，NOS測定采用比色法，實驗過程嚴格按試劑盒說明進行。

1.5.4 ET的測定

放免法。試劑盒購自北京北方生物技術研究所，實驗過程嚴格按試劑盒說明進行。

1.5.5 血漿ADMA和L-Arg測定

根據文獻，處理樣品。按1 ml血清加入20 mg的5-磺基水楊酸 （salicylsulfonic acid，SSA）沉淀蛋白，冰浴反應10 min，離心 （2 000g，10 min），吸取上清，0.45μ m的濾膜過濾后待測。L-Arg和ADMA標準品用50%甲醇配成100 mg/mL左右濃度的儲備液，-20℃儲存。臨用前用人工腦脊液（NaCl 7.605 g，KCl 0.223g，NaH2PO4?2H2O 0.072 g，NaHPO4?12H2O 0.014 g，NaHCO32.1 g，MgCl2?6H2O 0.162 g，CaCl20.144 g，溶解后定容至1 000 mL，pH=7.4）稀釋后測定，稀釋倍數分別為80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。將27 mg鄰苯二甲醛 （OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入 2-巰基乙醇 （2-MCE）20μ L，加入0.1 mmol/L四硼酸鈉緩沖液 （pH=9.5）至5 mL制得衍生液，避光室溫保存。上樣前將20μ L標準液或樣品液與10μ L衍生液混勻，精確反應90 s，進樣20μ L。流動相包括四種，各自成分如下:流動相A:100%甲醇，流動相B:純水，流動相C:25%甲醇，3%四氫呋喃，72%0.05M PBS，流動相D:70%甲醇，3%四氫呋喃，27%0.05M PBS，流動相均經0.45μ m濾膜過濾，超聲波脫氣后使用。采用Waters HPLC系統，分析柱為Inertsil ODS-2，流速為1 mL/min，溫度為30℃，熒光檢測調節為激發光338 nm、發射光425nm。

根據標準品作出標準曲線，計算出函數，將所測樣品的峰面積分別代入函數，計算 L-Arg及ADMA水平。

1.6 統計學分析

2 實驗結果

2.1 動物模型檢驗

對照組動脈各層結構完整，無鈣化及脂肪沉淀。各造模組大鼠主動脈切片可見內膜細胞增生及內皮下出現淡染的空泡等動脈粥樣硬化的早期病變，有些部位可見中膜平滑肌細胞增生、排列紊亂或隆起呈斑塊狀結構，有些部位中膜有明顯的鈣化形成，說明造模成功。

2.2 血清NO、NOS和ET濃度變化

實驗結果發現，動脈粥樣硬化各組的血清NO濃度無論在有氧訓練前和運動訓練安排的各時段均明顯低于對照組，其差異均具有統計學顯著意義。無論運動時間的長短，均可明顯改善血管內皮的NO釋放量，數據顯示各運動組的NO值均明顯高于安靜對照組和AS模型組。動脈粥樣硬化發展過程中，NOS的活力降低，AS模型組的NOS活性明顯低于安靜對照組，而有氧練習，不論時間長短，均可改善NOS的活性，各運動組NOS活性明顯提高，與模型組比較有顯著意義。ET水平在動脈粥樣硬化發展過程中明顯升高，有氧練習顯著的降低血清的 ET水平。（見表1）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

注:1）與對照組相比較P＜0.05; 2）與AS組比較P＜0.05

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2.3 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化

實驗結果發現，L-Arg的水平各組都沒有明顯變化，動脈粥樣硬化模型組的L-Arg和安靜對照組及各運動組比較逗沒有顯著差異。而血清ADMA水平在動脈粥樣硬化發病過程中有明顯上升，模型組和對照組相比有顯著差異。短時間的有氧練習 （30 min）對血清ADMA的影響不大，ASS組和模型組相比較沒有顯著差異，而較長時間的有氧練習明顯降低血清ADMA水平，ASM組和ASL組與模型組相比較都有顯著差異。實驗結果還顯示，動脈粥樣硬化發病過程中 L-Arg/ADMA比值明顯降低，不同時間的有氧練習均可以提高這一比值。

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

注:1）與對照組比較P＜0.05;2）與AS及ASL組比較P＜0.05

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3 討論

大量實驗證實，規則、周期性、中小運動強度的有氧運動可以預防動脈硬化，改善心血管健康。Maiorana A教授認為，運動改善心血管健康主要通過NO途徑實現，當前關于運動誘導NO釋放改善心血管健康的關鍵問題是:何種強度以及多長時間的運動更為有利。在動物實驗中，動物運動量和運動強度的把握，成為能否得到合理的實驗結果的制約因素。本實驗采用遞增運動負荷，靶強度為20 m/min，一次運動時間60 min的運動方案，根據加拿大學者Fernando研究的推斷，應為中等強度有氧運動。經本實驗室前期研究表明，這一強度的有氧練習可以有效改善動脈粥樣硬化的大鼠的血清NO釋放量。

動脈粥樣硬化 （athemsclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，它是由內皮細胞功能受損導致血管擴張和收縮功能障礙引起的。ET是內皮細胞分泌的一種最強的縮血管活性多肽，NO是一種很強的舒血管物質。正常情況下，內皮細胞所分泌的ET、NO應該處于一種平衡狀態，AS的內皮細胞功能異常主要表現為ET、NO的失衡。對于運動時內皮細胞功能改變的AS，有學者研究指出:NO是一種體內氧自由基清除劑，NO生成越少，則過氧化物生成越多，可促進AS的形成。本研究顯示，大鼠在動脈粥樣硬化發展過程中，血清NO量明顯降低，血清ET含量明顯上升，這和大部分的報道一致。不同實驗發現，不同時間的有氧練習均有利于增加血清的NO釋放量，提示各種強度的有氧練習均有利于改善心血管健康。但是不同時間的有氧練習對ET釋放的影響不一，長時間練習的效果明顯優于短時間的練習。

一氧化氮的生成主要通過NOS，利用L-Arg為底物合成。NO的生成依賴于NOS的活性和LArg的可利用度。一些學者假設給予L-Arg可能具有治療作用。，Adams等進行的一項以經血管造影證實的冠心病患者為研究對象的實驗中，10名患者隨機分為2組.L-Arg組給予口服 L-Arg，連用3天，對照組給予安慰劑口服，結果顯示內皮依賴性肱動脈舒張功能在L-Arg組得以改善。本實驗發現，在動脈粥樣硬化發展過程中，NOS活性降低，各運動組均可明顯提高血清NOS活性，與模型組相比有顯著意義的差異。

內源性NOS抑制物為L-精氨酸的同系物，其中研究較多的是不對稱二甲基精氨酸 （ADMA），其競爭性抑制NOS活性，使NO的抗動脈硬化作用減弱，導致動脈硬化的發生、發展。自ADMA第一次被認為是一氧化氮 （NO）途徑內源性抑制劑以來，它在調節NO產生中所起的作用越來越受到重視。在動脈中輸人ADMA能夠引起血管收縮。當前的實驗和l臨床數據表明ADMA濃度的輕微改變能顯著影響血管NO的產生，血管緊張度和全身血管抵抗。這表明ADMA可以作為一個內皮細胞功能紊亂的標記。因此，L-Arg/ADMA比值被認為是評價動脈粥樣硬化風險的重要指標。本研究發現，動脈粥樣硬化發展過程中，血清L-Arg值變化很小。但是，本實驗也發現動脈粥樣硬化模型組的血清ADMA值明顯升高，而L-Arg/ADMA比值下降。實驗結果表明，運動不會影響L-Arg水平，但是會降低 ADMA水平，從而改善 LArg/ADMA比值。

4 結論

4.1 實驗結果顯示，無論多長時間的有氧運動均可以顯著提高血清NO水平并明顯提高血清NOS的含量;不同時間的有氧練習均降低血清ET水平，但是較長時間的運動效果更為明顯。

4.2 動脈粥樣硬化發展過程中L-Arg濃度變化并不明顯，但是ADMA水平明顯上升。各種不同時間的有氧練習也不會改變血清L-Arg水平，但是較長時間的有氧練習有利于降低血清ADMA水平，因此可以有效改善L-Arg/ADMA比值。

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