人參皂甙Rg1和Rb1抗運動性中樞疲勞的實驗研究

馮毅羽中 潘華山 卞伯高 趙自明 陳楚杰

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州510006;2.廣東省中醫研究所廣東廣州510095）

近年來，隨著中樞神經系統 （CNS）生理學研究的深入，中樞神經系統在疲勞中的作用越來越受到學術界的關注，中樞神經系統功能的紊亂是運動性疲勞產生的重要原因之一。相關研究證實，神經遞質、神經調質、代謝產物的變化都對機體產生主要影響[1]。而中醫認為運動性疲勞的主要病機是氣虛陽弱，人參具有大補元氣之效。本研究根據 “虛則補之”的基本原理，選用中藥人參提取物人參皂甙Rg1和Rb1，對運動性疲勞大鼠進行灌胃治療，考察大鼠中樞神經遞質5-羥色胺 （5-HT）、γ-氨基丁酸 （GABA）、多巴胺 （DA）和乙酰膽堿（Ach）含量的變化，探討人參皂甙Rb1和Re抗運動性中樞疲勞的效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，180～220g，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號:SYXK（粵）2008-0085，使用動物質量合格證明編號:0031686。于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室內進行實驗，常規分籠喂養，自由飲水進食，動物室內溫度21～24℃，相對濕度40～55%，室內空氣流通，光照時間l2 h。

1.2 藥品、主要試劑與儀器

實驗藥品人參皂甙Rg1和Rb1均由上海同田生物技術有限公司提供，臨用時用生理鹽水按0.1ml/kg體重配成合適濃度后給藥。5-HT、GABA、DA和Ach標準品，由AMRESCO公司提供;其它化學試劑均由廣州新康醫學試劑公司提供，均為分析純。上述所有試劑均在有效期內使用。主要儀器有LC6A型島津高效液相色譜儀及其檢測器，ZH-PT動物實驗跑臺機。

1.3 運動疲勞模型的復制與分組方法

40只雄性SD大鼠，隨機均分為人參皂甙Rg1組 （50 mg/kg）、人參皂甙 Rb1組 （50 mg/kg）、模型組 （0.1ml/kg生理鹽水）和空白組 （等容量生理鹽水.），每天上午8時灌胃一次，1 h后將空白組放回籠中常規喂養，其余各組均進行中等運動強度的水平跑臺運動，速度為15 m/min，坡度0°，跑臺20 min，間歇40 min，再跑臺20 min，每天一次，連續14天。大鼠每兩天稱重一次，按照新體重調整灌胃量。

1.4 腦組織取材和勻漿制備

沿大鼠第一頸椎處剪斷脊髓，沿枕骨大孔與大鼠耳緣上連線處剪開顱腔，取完整全腦，用4℃生理鹽水清洗，濾紙吸干，立即置于放有冰塊的小盤內，參照大鼠腦立體定位圖譜及文獻介紹，在冰面上迅速分離下丘腦，稱重后-180℃保存。從下丘腦取新鮮冰凍的腦組織，電子天平稱重，加冰冷的0.1mol/L高氯酸，冰浴下制備腦組織勻漿，4℃，14 000×g離心20 min，取上清液，0.2μ m濾膜濾過、分裝，-80℃冷藏。

1.5 腦組織中樞神經遞質的測定

1.5.1 下丘腦5-HT和DA含量測定方法

C18柱 （4.6 mm ×250 mm ，5μ m），LC-10AD泵，SIL-10A自動進樣器，樣品量20μ L，流動相∶甲醇∶水 =40∶60，含 0.028 g/L EDTANa2，0.15 g/L SDS，0.2ml/L H2SO4，pH:2.5-3;流速:1.0 mL/min;CTO:10AVP，柱溫18℃，壓力為160kgf/cm2。L-ECD-6A電化學檢測器，CLASS-LC10 VER1.63工作站，以每克腦組織中遞質含量表示 （ng/g）。

1.5.2 下丘腦GABA含量測定方法

色譜條件:色譜柱:鋰柱10 cm×4.0 mm，柱溫:77℃，流動相:鋰緩沖液，流速14 ml/h;茚三硐顯色劑，將二甲亞砜與茚三酮配制成茚三酮顯色劑，流速:10 ml/h，進樣量:1000μ l，比色波長:570nm，GABA含量以每克下丘腦組織中GABA的量 （μ mol/g）表示。

1.5.3 下丘腦Ach含量測定方法

取上述制備的下丘腦勻漿上清液，以Na2HPO4（100 mmol/L）、5-HT四甲基氯化銨（0.5 mmol/L）、辛基磺酸鈉 （2.0 mmol/L）和0.005%“MB”試劑為流動相，重蒸去離子水定容，磷酸 （85%）調pH值為8.00。色譜條件為:ESA582型二元泵體系、ESA ACH-3色譜柱 （150×3 mm I.D.）、進樣量 10μ L、流速 0.35 mL/min。檢測條件為:5600A型電化學檢測器、ESA柱前酶反應器、ESAACH-SPR、M5040型分析電極、鉑工作電極、固態鈀參比電極;電勢為+300 mV。結果以每克組織中Ach含量 （mg/g）表示。

1.6 統計方法

采用單因素方差分析，組間均值比較采用SNK法，方差不齊時組間均值兩兩比較采用Dunnett T3法。以上數據均由SPSS15.0進行統計學分析。α=0.05。

2 結果

各項結果見表1。

表1 人參皂苷對運動性疲勞模型大鼠下丘腦各指標含量的影響

2.1 人參皂甙Rg1和Rb1對運動性疲勞模型大鼠下丘腦5-HT含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1組和Rb1組下丘腦5-HT含量均有顯著降低 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦5-HT含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

2.2 人參皂甙Rg1和Rb1對運動性疲勞模型大鼠下丘腦GABA含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1和Rb1組下丘腦GABA含量均有顯著降低 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦GABA含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

2.3 人參皂甙Rg1和Rb1對運動性疲勞模型大鼠下丘腦DA含量的影響

與模型組比較，人參皂甙Rg1組下丘腦DA含量有顯著性升高 （P＜0.05），空白組和Rb1組下丘腦DA含量均有顯著性升高 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦DA含量有顯著性升高 （P＜0.01）。

2.4 人參皂甙Rg1和Rb1對運動性疲勞模型大鼠下丘腦Ach含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1組和Rb1組下丘腦Ach含量均有顯著性升高 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦Ach含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

3 討論

3.1 運動性中樞疲勞與中樞神經遞質

神經遞質是一類在人體內負責傳遞神經信息的物質，中樞神經系統中各種神經元間的信息傳遞是由這類物質來完成的。關于中樞疲勞機制的一個重要學說是長時間運動時中樞神經遞質改變以及不同遞質 （興奮性和抑制性）之間相對平衡的破壞誘導了疲勞的發生[2]。新近的研究表明，運動性疲勞的發生主要和抑制性神經遞質5-HT與GABA、興奮性神經遞質DA與Ach四種神經遞質的改變密切相關。其主要機制是:1）激烈長期運動時腦干和丘腦的5-HT明顯升高，激發倦怠、食欲不振、睡眠紊亂等疲勞癥狀[3]。主要原因是隨著運動時間的延長血漿游離脂肪酸 （FFA）和支鏈氨基酸（BCAA）氧化增加，血漿中游離色氨酸 （f-Trp）的濃度相對上升，f-Trp/BCAA比值增加，進而引起進入腦內的f-Trp增多，而f-Trp是合成腦5-HT的前體，故5-HT也隨之增加[4]。2）在長時間運動后腦中抑制性氨基酸GABA的含量會升高，其原因在于一方面隨著去甲腎上腺素釋放的減少、ATP含量的下降，對谷氨酸脫羧酶的抑制作用減少，而造成GABA生產的增多;同時，疲勞時琥珀酸半醛脫氫酶活性下降，GABA氧化強度減弱，在腦中堆積[5]。3）多巴胺能作用是調節肌緊張，使機體做好進行運動的準備。而超常運動期間多巴胺活性減弱使其控制運動的能力下降，并通過運動協調的降低導致運動性疲勞的出現[6]。4）Ach是人體內普遍存在的神經遞質，與記憶、意識和溫度調節等有關。Ach的合成是由乙酰輔酶A（CoA）和膽堿在膽堿能神經元的標志酶-膽堿乙酰化酶作用下產生。而長時間運動會耗竭膽堿，導致Ach難以合成，進而產生疲勞[7]。

3.2 中醫對運動性疲勞的認識

中醫典籍中并無 “運動性疲勞”的論述，但與形體過用產生的疲勞及其相關病因病機的記載頗多。在中醫看來，運動性疲勞本屬過于勞動形體而產生的全身倦怠和精神困倦的生理病理過程[8]。如 《素問》中提出 “持重遠行，汗出于腎;疾走恐懼，汗出于肝;搖體勞苦，汗出于脾。故春夏秋冬，四時陰陽，生病起于過用，此為常也。”漢代張仲景在 《金匱要略》中提出，疲勞與 “虛勞病”同類，認為疲勞的病機為氣虛所致，有 “勞則氣耗，勞則喘息汗出，內外皆越，故氣耗矣”的論述。而 《千金方》中將 “勞”分為五勞，即肺勞、肝勞、心勞、脾勞、腎勞。現代中醫研究認為，運動性疲勞是由于強力運動導致臟腑正常機能下降，出現喘息、大汗出、疲乏等表現，其機理是過勞常勞其形體，傷其臟腑、神志，耗損大量陽氣、精血、津液，造成陰陽失和的狀態[9]。現代中醫研究雖然對運動性疲勞的改善提出了補肝腎、補脾腎、健脾胃、扶正理氣等等諸多不同的方法，但大多數研究者都認同“虛則補之”的治法，即以進補的方式改善臟腑功能、促進疲勞的恢復。

3.3 人參皂甙Rg1和Rb1抗疲勞的療效與機制

《神農本草經》把人參列為上品，有 “主補五臟、安精神、止驚悸、除邪氣、明目、開心益智”的記述。現在研究表明人參皂甙是人參生理活性最重要的有效成分，從植物人參和西洋參中已分離出20余種皂甙。根據中醫理論 “虛則補之”，可以選擇人參及其主要提取物人參皂甙進行運動性疲勞的防治研究和運用。以往研究表明[10～14]，人參皂甙Rg1和Rb1是人參促智的主要有效成分。人參皂甙Rg1具有抗氧化、抗衰老，減輕神經功能損傷的作用，人參皂甙Rg1和Rb1均具神經營養和選擇性神經保護作用，可促進神經元突觸再生、增強膽堿能神經元抗損傷、保護谷氨酸誘導的神經細胞死亡率的作用、降低大鼠中風病急性期缺氧、缺糖再給氧損傷神經和星形膠質細胞等死亡率。本實驗通過對中等強度的跑臺運動復制的運動性疲勞模型大鼠中樞神經遞質5-羥色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺和乙酰膽堿含量的測定，發現人參皂甙 Rg1和Rb1均能有效的降低下丘腦5-HT和GABA的含量，提高DA和Ach的含量;和人參皂甙Rg1比較，人參皂甙 Rb1在降低5-HT和GAGB含量、提高DA含量方面效果更優，但在提高Ach含量方面效果相對較差。總的說來，人參皂甙Rg1和Rb1均能改善運動性疲勞狀態下中樞神經遞質紊亂的情況，從而對中樞神經系統產生保護作用，達到抗中樞疲勞的效應，但人參皂甙Rb1的效果相對更優。

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