曲古菌素A對食管癌細胞系EC1細胞凋亡的影響*

馬俊芬,李 沛,黃幼田,楊洪艷,鄭智敏,董子明

鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年生,博士,教授,研究方向:腫瘤發病機制及生物治療,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一種組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)抑制劑,能抑制組蛋白去乙酰化酶的活性。它能夠通過改變組蛋白的乙酰化狀態,從而選擇性地調控腫瘤相關基因,已成為一種新的腫瘤治療制劑[1-2]。TSA對腫瘤的抑制作用可以表現在以下幾個方面:細胞周期的阻滯,誘導凋亡及抑制血管增生。為了解 TSA對食管癌EC1細胞凋亡的影響,作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 RPMI 1640(美國Gibco公司),胎牛血清(天津TBD生物有限公司),TSA(美國Sigma公司),Annexin V-FITC試劑盒(江蘇碧云天生物公司),Bax鼠抗人單抗及Bcl-2兔抗人單抗(美國Santa Cruz公司),食管癌EC1細胞(香港大學曹世華教授惠贈)。

1.2 細胞培養 EC1細胞在含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中培養至對數生長期,然后分為 4組,實驗 1、2及 3組分別用含 0.3、0.5和1.0μmol/L TSA培養,對照組用0.44 g/L的DMSO培養。

1.3 流式細胞儀檢測凋亡細胞 分組作用 24 h后,收集細胞上清,用 0.5 g/L胰蛋白酶消化細胞,細胞懸液與上清液合并,離心,制備單細胞懸液,進行細胞計數。取至少 106個細胞移入新的 1.5 mL EP管中,190μL冰預冷 1×結合緩沖液重懸細胞,加10μL Annexin V-FITC輕輕混勻,室溫避光放置10min,1 000 r/min離心5min,棄上清,加入195μL 1×結合緩沖液重懸細胞,加入5μL PI,室溫避光孵育10m in。另設未染色管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管;以未染色管調零機器,以Annexin VFITC單染管和PI單染管作為基準參照,測定每個上樣管數據,利用CellQuest 3.0軟件進行參數獲取和資料分析,計算凋亡細胞百分比。

1.4 Western Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達分組作用 24 h后,按照細胞總蛋白試劑盒說明提取總蛋白,Bradford法檢測蛋白質的含量,50μg上樣量,用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分離,轉移至PVDF膜上,用50 g/L牛血清白蛋白封閉3 h,分別加入Bax和Bcl-2一抗,4℃過夜。將膜放于TBST稀釋的二抗中,室溫輕搖2 h,用TBST洗滌3次,使用HRP-ECL發光法顯影,結果用Gel-Doc圖像分析軟件進行分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS 10.0進行統計學處理。4組細胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達的比較行單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni法,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞凋亡率測定結果 與對照組相比,實驗1組細胞的凋亡率無明顯變化,隨著TSA濃度升高,實驗 2、3組細胞凋亡率呈增加趨勢,見表 1。

2.2 4組細胞Bax、Bcl-2表達的變化 與對照組相比,0.3μmol/L TSA處理后EC1細胞促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達無明顯變化,0.5μmol/ L TSA處理后EC1細胞Bax的表達增加,而Bcl-2的表達減少,1.0μmol/L TSA處理后EC1細胞Bax的表達增加和Bcl-2表達減少更明顯。見圖1,表1。

圖1 4組細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達

表1 4組細胞凋亡率(n=5)及Bax和Bcl-2蛋白表達(n=3)的比較

3 討論

TSA源自鏈霉菌代謝產物,是一種強效HDAC抑制劑。HDAC抑制劑通過活化凋亡信號轉導通路,促進凋亡相關蛋白的表達,誘導細胞凋亡。與細胞凋亡相關的信號轉導通路主要包括死亡受體和線粒體凋亡信號轉導通路。在死亡受體信號轉導通路中Fas、FasL及TRAIL是主要蛋白,Insinga等[3]研究表明HDAC抑制劑丙戊酸可以通過選擇性上調白血病細胞中Fas、FasL及TRAIL的表達,從而活化死亡受體凋亡信號轉導通路,誘導白血病細胞凋亡。HDAC抑制劑還可以調控Bcl-2家族蛋白的表達和亞細胞定位,活化線粒體凋亡信號通路而誘導細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是一類調控細胞凋亡的蛋白,主要分為兩大類:一類包括Bax、Bid、Bcl-xs等含BH3結構域的促凋亡蛋白,這些蛋白形成同源二聚體,嵌在線粒體膜上,通過增強線粒體膜通透性,促進細胞色素c(Cytc)和凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)的釋放,誘導細胞凋亡;另一類是抗凋亡蛋白,包括Bcl-xL和Bcl-2,這些蛋白過表達后與Bcl-2家族中的促凋亡蛋白結合形成異源二聚體,從而阻斷Cytc和AIF的釋放,抑制細胞凋亡[4]。

作者分別用0.3、0.5、1.0μmol/L TSA培養細胞24 h,用Annexin V-FITC和PI雙染色流式細胞儀檢測EC1細胞的凋亡情況。結果顯示,與對照組比較,0.3μmol/L TSA處理24 h后細胞凋亡率沒有明顯變化,0.5μmol/L TSA處理后EC1細胞凋亡率增加;隨著TSA作用濃度的增加,Bax的表達量增加,而Bcl-2則減少。表明TSA可以引起促凋亡基因蛋白Bax表達上調和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下調,從而引起EC1細胞凋亡,其機制可能為:一方面TSA可以在轉錄水平上調Bax和下調Bcl-2蛋白的表達水平,使線粒體膜的通透性增強而活化線粒體凋亡信號通路[5-7];另一方面TSA通過調控Bcl-2家族蛋白的亞細胞定位誘導細胞凋亡,這種作用和細胞質中DNA末端識別和結合蛋白Ku70蛋白密不可分,Ku70可與Bax結合,抑制Bax向線粒體膜的轉運。TSA促進Ku70的乙酰化水平,使其釋放與之結合的Bax[8]。Bax轉運到線粒體膜上,形成同源二聚體,增強線粒體膜的通透性,引起Cytc的釋放,誘導EC1細胞的凋亡。Bax既可以自身形成同源二聚體,又可以與 Bcl-2結合成異源二聚體并定位于質膜上,Bcl-2與Bax的結合是Bcl-2發揮作用的前提。當 Bax在細胞內過量表達,形成同源二聚體增多,破壞了Bcl-2與Bax的結合。與Bax分離的Bcl-2失去抗凋亡能力,使細胞對死亡信號的反應增強。

總之,TSA作用EC1細胞后可以通過調控Bcl-2家族蛋白的表達和亞細胞定位兩個方面,活化線粒體凋亡信號通路,誘導細胞凋亡[9],但是否還與其他基因的表達改變有關尚有待進一步研究。

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