氯沙坦對兔腹主動脈內皮損傷后過氧化物酶體增殖物激活受體-γ與纖溶酶原激活物抑制因子-1表達的影響

劉 慧,高傳玉,李海劍,李玉東,楊守忠,毛紹芬,陶雅非

1)河南省人民醫院心內科鄭州 450003 2)南陽市中心醫院心內科南陽 473009 3)南陽市中心醫院腎內科南陽 473009 #通訊作者,男,1962年生,博士,主任醫師,研究方向:冠心病的診斷與治療,E-mail:gaocy2000@yahoo.com.cn

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)是甾體激素受體超家族的新成員,能被脂肪酸以及外源性過氧化物增殖物激活,在轉錄水平上調節脂質代謝、脂肪細胞分化和細胞因子的產生。研究[1-3]表明,PPARγ具有整體的抗炎癥和抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)功能。作為臨床上廣泛應用的血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(AT1R)拮抗劑氯沙坦,其抗AS作用是否與PPARγ有關,目前未見報道。作者建立了兔腹主動脈 AS模型,觀察氯沙坦對血管成形術后PPARγ和纖溶酶原激活物抑制因子-1(p lasm inogen activator inhibitor-1,PAI-1)表達的影響,以進一步探討氯沙坦對AS和斑塊穩定作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 新西蘭大白兔24只,雄性,體質量(2.5±0.3)kg,河南省實驗動物中心提供。隨機分為普通飼料喂養組(G1組)、高脂飲食喂飼+動脈內皮損傷組(G2組)及高脂飲食喂飼+動脈內皮損傷+氯沙坦治療組(G3組),每組8只。

1.2 試劑及儀器 PPARγ、PAI-1一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。球囊由Cordis公司提供。日本HMIS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統。1.3 動物模型的建立 G1組家兔喂以普通飼料。G2、G3組家兔以含質量分數1.5%膽固醇的飼料飼養2周后行腹主動脈內膜剝脫術。參考 Block等[4]的方法并加以改進,制作腹主動脈球囊損傷模型。術后G2、G3組繼續以高脂飲食喂養 6周,G3組每天加用氯沙坦(商品名科素亞,美國默沙東公司提供)10 mg/kg。

1.4 組織標本留取 術后6周處死各組家兔,取出腹主動脈,截取成形部位血管標本,4 g/L多聚甲醛固定 4 h。逐級脫水,石蠟包埋,4μm厚連續切片,采用電腦圖像分析儀分別測定新生內膜厚度(intimal thickness,IT)、中膜厚度(media thickness,MT)、內膜面積(intimal area,IA)及中膜面積(media area, MA),計算新生內膜厚度與中膜厚度比(IT/MT)及內膜面積與中膜面積比(IA/MA)。

1.5 腹主動脈PPARγ和PAI-1蛋白檢測 PPARγ

及PAI-1免疫組織化學染色采用常規親和素-生物素-過氧化物酶技術,具體步驟參照試劑盒說明書。PPARγ、PAI-1陽性著色均表現為胞質染成淺黃色、棕黃色或棕褐色。每張切片高倍鏡下取 10個視野,計算每個視野下陽性表達的血管平滑肌細胞占總血管平滑肌細胞的百分比,結果取平均值。

1.6 腹主動脈PPARγ和PAI-1mRNA檢測 組織總RNA提取按Trizol說明書進行。RT-PCR采用兩步法。10μg總RNA配制逆轉錄反應體系,25℃10min,42℃60 min,70℃10min,逆轉錄合成cDNA,以此為模板用PPARγ、PAI-1引物經PCR方法進行擴增,反應總體積為 25μL。引物由北京奧科公司合成。PPARγ引物序列:上游5'-CACAA GAACAAATGCCAGTA-3',下游5'-GGTCCTCAGTG GAAGAATCG-3';PAI-1引物序列:上游5'-TGG ACTTGACCACGGAGGAGC-3',下游5'-CTCGGTG CCCTTCAGTGAGCT-3';內參照β-actin引物序列:上游5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3',下游5'-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3'。PPARγ擴增條件為:95℃5 min;94℃30 s,63℃50 s,72℃30 s,共35個循環;最后72℃延伸6min,終產物為521 bp。PAI-1擴增條件為:95℃5m in;94℃30 s,59℃40 s,72℃40 s,共 35個循環;最后72℃延伸6 min,終產物為480 bp。β-actin終產物為332 bp。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,應用圖文分析系統,以目的基因片段/β-actin片段的條帶灰度值比值來表示其相對表達量。

1.7 統計學處理 采用SPSS 10.0對3組腹主動脈IT、IT/MT比值、IA、IA/MA比值、PPARγ和PAI-1蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量行單因素方差分析及SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組腹主動脈IT、IT/M T、IA及IA/MA比值的比較 結果見表1。

表1 3組腹主動脈IT、IT/MT比值、IA及IA/M A的比較

2.2 3組腹主動脈PPARγ和PAI-1蛋白的表達 結果見圖1、圖2及表2。

表2 3組腹主動脈PPARγ及PAI-1蛋白陽性表達率和m RNA相對表達量的比較

2.3 3組腹主動脈PPARγ及PAI-1 mRNA的表達 結果見表2、圖3和圖4。

圖3 3組腹主動脈PPARγm RNA的RT-PCR結果

圖4 3組腹主動脈PAI-1m RNA的RT-PCR結果

3 討論

AS是多種病因造成的始發于動脈壁內膜的一系列分子和細胞改變的結果。PPAR屬Ⅱ型核受體超家族成員,可在AS斑塊處表達,在AS有關的脂質代謝和血管炎癥中起關鍵作用[3]。該研究中,兔腹主動脈內皮損傷后,局部PPARγ表達增加,提示內皮損傷可以刺激 PPARγ過度表達。在相應配體的作用下, PPAR可以下調某些致病基因的表達。研究[5]表明, PPARγ激動劑能夠通過抗炎、抗氧化、保護內皮細胞、抑制平滑肌細胞增殖和遷移、調節脂質代謝及穩定斑塊等多種途徑,從整體上發揮抗AS作用。

近年發現血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)除了降壓以外,還具有抗纖維化、抗卒中、降尿酸、抗房顫(AF)、治療舒張期心力衰竭及抗AS等[6]多種作用。其中僅有替米沙坦被證實是PPARγ的一種部分激動劑,通過激活PPARγ發揮抗AS作用[7]。而目前廣泛應用的氯沙坦的抗 AS作用是否與PPARγ有關,尚未見報道。

PAI-1是體內最重要的纖溶活性調節劑,調節纖溶平衡[8]。PAI-1致AS的主要機制是阻止纖溶酶形成及細胞外基質的降解,調節平滑肌細胞增殖和遷移,有助于形成阻塞性斑塊而導致臨床事件發生。該研究中,球囊拉傷動脈導致PAI-1在血管內皮細胞和平滑肌細胞過度表達。PAI-1異常表達所致的細胞表面纖溶活性降低可引起或加重血栓形成。

總之,該研究建立了兔腹主動脈 AS模型,觀察氯沙坦對血管成形術后PPARγ和PAI-1表達的影響。結果表明,兔腹主動脈內皮損傷,發生 AS后,局部 PAI-1表達異常升高,與國外相關研究[9]一致,給予氯沙坦干預后明顯下降,同時 PPARγ表達增加。有研究[10]表明,PPARγ激活后可以抑制PAI-1表達。該研究結果表明,氯沙坦抑制PAI-1表達,抗AI,可能與激活PPARγ有關,但其具體機制及信號途徑有待進一步研究。

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