乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3的表達及與淋巴管生成關系的研究

楊淑改 王福安 李惠翔 臧衛東

淋巴道轉移是乳腺癌最常見的轉移途徑。胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)足近年來發現的細胞生長因子，TP通過血管生成作用促進癌細胞的生長和轉移[1-3]。TP除促進血管生成作用外，也具有促淋巴管生成作用。血管內皮生長因子-D(vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)與其受體血管內皮生長受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)相結合后促進腫瘤淋巴管生成和擴張，與淋巴結轉移密切相關[4]。D2-40是目前敏感性和特異性均較高的淋巴管內皮特異性標記物[5]。本研究應用 SP免疫組化法檢測乳腺癌和正常乳腺組織中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達及 D2-40標記的陽性淋巴管數，探討其與乳腺癌臨床生物學行、轉移及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本及臨床病理資料 收集鄭州大學一附院 2004-2006年乳腺癌手術切除標本 37例和正常乳腺組織手術切除標本 30例，乳腺癌患者術前均無放療、化療及其他治療史年齡 31～75歲，平均年齡(50±17)歲。經病理證實，37例乳腺癌組織均為浸潤性導管癌，其中年齡 ＜50歲的 23例，年齡≥50歲的 14例；腫瘤直徑 ＜20 mm的 10例，≥20 mm的 27例；有淋巴結轉移 20例，無區域淋巴結轉移 17例；組織學分級:Ⅰ級 7例，Ⅱ級 22例，Ⅲ級 8例。

1.2 主要試劑 TP鼠抗人單克隆抗體，購自 Roche公司(法國)；VEGF-D兔抗人多克隆抗體，購自武漢博士得公司；VEGFR-3即用型多克隆抗體、D2-40單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組化SP檢測試劑盒、DBA顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法 選取乳腺癌及正常乳腺組織存檔臘塊，連續 4μm切片，采用免疫組織化學SP法依試劑盒提供步驟操作，陽性對照切片由試劑公司提供，以 0.01 mol/LPBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 TP免疫組化信號位于細胞漿內，呈棕色或棕黃色顆粒，以免疫組化量化后數值:≤2者為陰性，＞2者為陽性。VEGF-D免疫組化陽性信號位于細胞漿內，呈棕色或棕黃色，以棕色或棕黃色顆粒的陽性細胞數≥10%為陽性，＜10%為陰性。VEGFR-3陽性表達主要位于間質細胞和腫瘤細胞胞漿內，為淺黃色至棕褐色顆粒，不著色至弱著色為陰性表達，中等著色至強著色為陽性表達。D2-40染色陽性標記的脈管數視為 LVD，參照 weidner[6]方法進行計數。

1.5 統計學分析 應用 SPSS 11.0統計軟件，計量資料以 ˉx±s表示，采用 t檢驗，計數資料采用 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達及淋巴管計數 37例乳腺癌組織中 TP、VEGF-D、VEGFR-3的陽性率和淋巴管計數明顯高于 30例正常乳腺組織中的陽性率和淋巴管計數(P＜0.05)。見表 1。

表 1 乳腺癌組織和正常乳腺組織中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達及淋巴管計數 %

2.2 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達及 LVD與乳腺癌臨床病理特征及預后的關系 TP、VEGF-D、VEGFR-3陽性率及 LVD在淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組織(P＜0.05)，組織學分級越高，TP、VEGF-D、VEGFR-3表達 LVD增強(P＜0.05)。見表2。

表 2 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達及 LVD與臨床病理特征的關系

2.3 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達與淋巴管計數關系

TP、VEGF-D、VEGFR-3陽性表達中 LVD明顯高于 TP、VEGFD、VEGFR-3陰性表達(P＜0.01)。見表 3

表 3 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表達與淋巴管計數關系

3 討論

乳腺癌是女性最常見，最多發的惡性腫瘤，嚴重危害其生命健康，乳腺癌容易發生淋巴結轉移，淋巴管是腫瘤細胞擴散的主要途徑[7]，腫瘤誘導淋巴管生成是淋巴道轉移的重要步驟。腫瘤淋巴管生成造成淋巴管密度增加，使腫瘤細胞有更多的機會侵入毛細淋巴管，進入區域淋巴結，形成了淋巴道轉移[8]。TP可逆性催化胸苷去磷酸化，誘導明顯的血管新生。是否有淋巴管生成作用未見報道。本研究發現，乳腺癌 TP陽性表達率明顯高于正常乳腺組織，無淋巴結轉移組，組織學分級Ⅰ級病例 TP表達陽性率明顯低于有淋巴結轉移及Ⅱ或Ⅲ病例，說明TP表達與乳腺癌發生、進展及轉移等生物學行為有密切關系。乳腺癌中 TP陽性表達淋巴管計數明顯高于陰性病例。況明 TP具有促進腫瘤淋巴管生成作用。

VEGF-D為淋巴管生長因子，可與淋巴管內皮細胞上的VEGFR-3結合并使之激活，促進淋巴管內皮細胞的增殖和淋巴管的生成[9]。本研究中 VEGF-D、VEGFR-3在乳腺癌組織中表達高于正常乳腺組織，提示 VEGF-D、VEGFR-3在腫瘤發生發展中起作用:VEGF-D、VEGFR-3在淋巴結轉移組及組織學分級Ⅲ級明顯高于無淋巴結轉移組及組織學分級Ⅰ級或Ⅱ級，表明VEGF-D、VEGFR-3與乳腺癌淋巴道轉移有關，是乳腺癌預后的一項輔助判斷指標:VEGF-D、VEGFR-3陽性表達中淋巴管計數顯著高于陰性病例，表明 VEGF-D、VEGFR-3具有促進腫瘤淋巴管生成作用。

腫瘤胚胎性抗原 M2A是一種 40KD的唾液酸糖蛋白，D2-40最初是從胎兒的睪丸和生殖細胞腫瘤中分離出的 M2A抗原，能與淋巴管內皮反應，不與血管內皮反應，被認為是最具特異性的淋巴管標記物。本實驗中 D2-40特異性地表達在淋巴管內皮細胞內，癌栓多見于癌周圍擴張淋巴管。乳腺癌組織中LVD顯著高于正常乳腺組織，提示乳腺癌中有大量淋巴管生成；LVD在淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組；組織學分級越高 LVD越大，提示淋巴管數量多少與淋巴結轉移密切相關，是判斷乳腺癌預后的重要指標。乳腺癌組織中TP、VEGFD、VEGFR-3的表達及淋巴管計數具有高度的一致性，表明三者在乳腺癌的淋巴管生成，淋巴結轉移中起協同作用。

由此可見:TP、VEGF-D、VEGFR-3可促進乳腺癌淋巴管生成，是乳腺癌經淋巴道侵襲轉移的重要因子，淋巴管數目的增多，使癌細胞更易于侵入淋巴管從而促進了淋巴結轉移。乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3有助于判斷乳腺癌的轉移和預后。

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