糖尿病腎病大鼠炎性細胞因子的變化

郄會卿 董煥娥 吳亞 王春秀 劉東梅

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見而嚴重的慢性微血管病變的并發癥，是引起終末期腎病的最常見病因之一。在 DN的發生發展過程中，糖或脂代謝紊亂、氧化失衡、血管活性物質、遺傳因素以及細胞因子等均起著重要作用。目前，炎性反應在DN發病中的作用越來越受到人們的關注。本實驗旨在觀察DN大鼠血液細胞因子白介素(IL)-6、IL-8、IL-10、C-反應蛋白(CRP)變化并從炎癥方面探討其可能的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重 100～120 g清潔級、健康雄性 Wistar大鼠 24只，河北省實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 IL-6、IL-8、IL-10購自美國 Sigma公司；CRP、血糖、尿素氮、肌肝均購自上海科華生物工程股份有限公司；芬蘭產 Multisken Ascent型全自動酶標儀；日本產日立 7170-A全自動生化分析儀。

1.3 動物模型及試驗方法 按Anderson等[1]建立的方法，將24只雄性Wistar大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后行右腎切除術。2周后將大鼠隨機分為 2組，即右腎切除對照組(C組，n=12)、DN模型組(DN組，n=24)。C組只注射等量的枸櫞酸緩沖液。DN模型采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(65mg/kg，溶于 p H值 4.5枸櫞酸緩沖液中)誘導，于給藥后 48h測血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖 +++～++++者確定為 DN模型，實驗期間動物自由進食飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。DN模型建成后，每周測血糖 1次，不符合標準者棄去。分別于第 8、12周末每組取 6只大鼠處死，處死后迅速取出左腎稱重。處死前分別用代謝籠收集 24 h尿，測尿蛋白；股動脈取血，分離血清，檢測 IL-6、IL-8、IL-10、CRP、血糖、尿素氮、血肌酐。

1.4 觀察指標 采血完畢，立即打開腹腔游離腎臟稱重。CRP采用免疫比濁法，血糖用葡萄糖氧化酶法，肌肝用堿性苦味酸法，尿素 氮用紫外-谷氨 酸脫氫酶法。 IL-6、IL-8、IL-10采用ELASA酶免法。

1.5 統計學分析 應用SAS 9.2統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，顯著性檢驗采用兩兩比較的Q檢驗分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

DN組 8、12周大鼠腎重/體重比值、血糖、尿素氮、肌肝、24 h尿蛋白、CRP、IL-6、IL-8、IL-10與 C組相應時間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。 IL-10與 CRP、IL-6、IL-8呈負相關(r值分別為 -0.5491、-0.6285、 -0.6984，P＜0.05)。見表 1。

表 1 2組觀察指標比較n=6，ˉx±s

3 討論

DN的發生發展是多因素綜合作用的結果。其病理特點為腎小球基底膜增厚、腎小球系膜區細胞外基質沉積，最終腎小球硬化伴或不伴腎小管間質纖維化。有關炎性因子及促炎性因子與 DN的發生發展密切相關，并認為DN是一種炎癥性疾病[2]。IL-6、IL-8、CRP是重要的致炎性細胞因子，而 IL-10是抑制多種致炎性細胞因子分泌的抗炎性細胞因子之一。本研究結果顯示 DN大鼠血中炎性因子 IL-6、IL-8、CRP顯著高于對照組(P＜0.05)，而抗炎性細胞因子 IL-10顯著低于 C組(P＜0.05)，提示 DN疾病的發病過程存在急性時相反應，IL-6、IL-8、IL-10、CRP在糖尿病腎病的發生發展中起重要作用，DN的發生發展過程中炎性細胞因子分泌活躍，而抗炎細胞因子分泌相對減弱。炎性反應可通過多種途徑導致腎臟損傷。高糖可致腎小球系膜細胞產生IL-6[3]，IL-6又可直接刺激腎小球系膜細胞增殖，細胞外基質的合成，使腎小球濾過膜增厚，導致腎小球硬化，腎小管功能損害，并作用于血管內皮細胞，誘導其表達黏附分子和促凝血因子，黏附炎癥細胞，促進血管內血栓形成，增加毛細血管通透性，從而促進 DN的發生發展。IL-8有較強的趨化和激活嗜中性粒細胞、淋巴細胞的作用，在炎性反應中起重要作用，研究發現 2型糖尿病腎病患者尿液中IL-8水平升高并與血液中糖基化血紅蛋白水平呈正相關[4]，提示 IL-8參與誘發和維持DN的炎性反應，并可能影響腎臟功能。IL-8通過影響腎小球基底膜上硫酸化合物的代謝使腎小球基底膜通透性增高[5]，在腎小球炎癥及腎小球硬化過程中其重要作用。CRP是主要由肝細胞合成的炎癥相關急性時相反應蛋白，IL-6等細胞因子也可刺激肝細胞生成 CRP。國外研究報道在糖尿病所有微血管并發癥中只有 DN和血清中CRP水平有關，說明炎性反應在 DN的發生發展中發揮著重要作用[6]。CRP可直接作用于腎小球小動脈，使血管內皮細胞功能障礙，白細胞或血小板對內皮細胞的黏附性和通透性增加，加重腎小球高濾過高灌注狀態，引起腎臟損傷導致DN的形成。

IL-10又名細胞因子合成抑制因子，是重要的抗炎因子之一，主要由單核-巨噬細胞、T細胞、B細胞產生。作為一個重要的免疫調節因子，一方面抑制炎性細胞如單核細胞、淋巴細胞等的黏附浸潤，另一方面可抑制單核細胞、巨噬細胞抗原遞成功能，抑制合成、釋放前炎性細胞因子，通過多種途徑發揮抗炎作用。IL-10能抑制中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及單核細胞分泌產生 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等前炎性細胞因子，并能調節纖溶系統，抑制內毒素血癥時的凝血反應；另外，炎性細胞因子也可調節 IL-10的產生。它們之間形成了復雜的細胞因子網絡，相互協調，相互作用。本研究相關分析提示IL-10與致炎細胞因子與 IL-6、IL-8、CRP顯著負相關(P＜0.05)，提示 DN發生發展中抗炎細胞因子與致炎細胞因子共同發揮作用。DN的發生時炎性 IL-10分泌減少，不足以對抗炎性細胞因子的作用，而體內過高的炎性因子則通過刺激腎小球系膜細胞的增生，使腎小球肥大，導致腎小球硬化，并能誘生氧自由基增多而損傷血管內膜。同時還能誘導血管內皮細胞產生血小板活化因子，抑制抗凝血功能，促進血栓的形成，最終導致腎功能受到損害。

總之，DN的發生發展與炎性細胞因子和抗炎細胞因子的失衡有關，炎性細胞因子分泌活躍，而抗炎細胞因子分泌相對減弱。抗炎細胞因子產生的量不足以對抗促炎因子的作用，最終導致 DN的發生。檢測糖尿病腎病血清中的 IL-6、IL-8、IL-10、CRP水平變化，對臨床的診斷、治療及指導臨床用藥有重要的意義。

1 Anderson S，Rennke HG，Brenner BM.Nifedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats.Kidney Int，1992，41:891-897.

2 Mora C，Navarro JF.The role of inflammation asa pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes.Curr Diab Rep，2005，5:399-401.

3 Ihm CG，Park JK，Kim HJ，et al.Effects of high glucose on interleukin-6 production in human mesangial cells.J Korean Med Sci，2002，17:208-212.

4 Tashiro K，Koyanagi I，Saitoh A，et al.Urinary levels of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)and interleukin-8(IL-8)，and renal injuries in patients with type 2 diabetic nephropathy.J Clin Lab Anal，2002，16:1-4.

5 孫萬森，王娟，王竹，等.祛風通絡方對系膜增生性腎小球腎炎大鼠蛋白尿及血清 IL-6與 IL-8的影響.中國中西醫結合腎病雜志，2009，10:584-586.

6 Kang ES，Kim HJ，Ahn CW，et al.Relationship of serum high sensitivity C-reactive protein to metabolic syndrome and microvascular complications in type 2 diabetes.Diabetes Res Clin Pract，2005，69:151-159.