高壓處理對(duì)西瓜生長(zhǎng)及其品質(zhì)的影響

李海濤，蘇磊，李國(guó)申

高壓處理對(duì)西瓜生長(zhǎng)及其品質(zhì)的影響

李海濤1，蘇磊2，李國(guó)申1

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，河南開封，475004；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院物理系）

以西瓜為研究材料，利用高壓裝置，以水為傳壓介質(zhì)，研究了靜水高壓（50 MPa，100 MPa，150 MPa）處理西瓜種子對(duì)成苗率、幼苗葉綠素含量、過氧化物酶活性和西瓜果實(shí)農(nóng)藝性狀的影響。結(jié)果顯示，加壓組（萌動(dòng)種子和干種子）的成苗率下降，方差分析表明，兩組西瓜種子的成苗率差異顯著；加壓組的葉綠素a、類胡蘿卜素的含量均比對(duì)照組低，生長(zhǎng)受到抑制；與對(duì)照組相比，加壓組葉片的過氧化物酶活性明顯增高，抗逆性增強(qiáng)，果實(shí)中心糖含量升高。總的來說，高壓處理種子使西瓜前期生長(zhǎng)受到抑制，后期有利于抗逆性增強(qiáng)、品質(zhì)提高。

西瓜；高壓；光合色素；過氧化物酶

高壓生物學(xué)是近年來由高壓物理學(xué)和生物學(xué)發(fā)展起來的一門交叉學(xué)科，由于分子生物學(xué)和高壓物理學(xué)技術(shù)的不斷深入和迅速發(fā)展，高壓分子生物學(xué)已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)之一[1]。高壓環(huán)境對(duì)于在常壓下生長(zhǎng)的生物來說是一種逆境，對(duì)植物能產(chǎn)生傷害甚至致死作用，生活中常用來進(jìn)行（高壓）滅菌和食品加工等。白成科等[2～3]利用靜水高壓處理水稻種子，發(fā)現(xiàn)高靜水壓能夠影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，并能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生變異，認(rèn)為靜水高壓處理對(duì)水稻來說是一種逆境脅迫，能夠影響水稻一生的發(fā)育，從而使有效穗數(shù)和株高等主要農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯改變，而且篩選出穩(wěn)定遺傳的變異植株。蘇磊等[4]高壓處理大豆種子，不僅單株籽粒產(chǎn)量提高了30.6%，而且營(yíng)養(yǎng)成分均朝著有利于提高品質(zhì)的方向變化。

種子的萌發(fā)是植物一生中新陳代謝重新啟動(dòng)和生命開始的重要階段，而有關(guān)高壓處理種子對(duì)西瓜的成苗率、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量品質(zhì)的影響還未見報(bào)道。本研究利用靜水高壓（50 MPa，100 MPa，150 MPa，相同處理時(shí)間20 min）處理干西瓜種子、萌動(dòng)西瓜種子，通過統(tǒng)計(jì)成苗率，跟蹤調(diào)查其幼苗期的生長(zhǎng)、葉片中葉綠素的含量及過氧化物酶的活性，以及對(duì)品質(zhì)的影響，來探討高壓逆境鍛煉對(duì)西瓜生長(zhǎng)發(fā)育影響的規(guī)律和作用機(jī)制，為高壓誘變育種提供更加全面和豐富的資料，以期進(jìn)一步揭示高壓誘變的生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西瓜（Citrullus lanatus）材料由河南大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。選用不同類型的5個(gè)西瓜品種材料（純合自交系）的種子：日本瓜（小型瓜），金小蘭（小型瓜），郭牟（大型瓜），蜜玫綠（四倍體），金玫黑（四倍體）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每一品種隨機(jī)分成7份，隨機(jī)選用3份，用55℃水浸種攪拌，自然降溫后浸種6 h，置于30℃恒溫箱中催芽6 h（稱為萌動(dòng)），再分別用50 MPa、100 MPa、150 MPa靜水壓處理20 min；每個(gè)品種再隨機(jī)選3份，分別用50 MPa、100 MPa、150 MPa靜水壓處理干種子20 min；最后1份種子作對(duì)照（CK）。種子處理后（2009年4月15日）立即用陽(yáng)畦育苗，5月5日移植到大田地膜覆蓋栽培，統(tǒng)一施肥澆水和田間管理。花期人工授粉，掛牌標(biāo)記，根據(jù)不同品種成熟情況于7月上中旬采收。采摘后稱質(zhì)量，剖開，用手持糖量計(jì)測(cè)中心部位含糖量，每個(gè)材料重復(fù)3次（即測(cè)3個(gè)單瓜），保存種子。

1.3 試驗(yàn)方法

①成苗率的測(cè)定 將處理和對(duì)照種子于4月15日播種到培養(yǎng)缽內(nèi)育苗，期間分3次統(tǒng)計(jì)出苗率，按幼苗生長(zhǎng)較正常且長(zhǎng)出真葉的植株統(tǒng)計(jì)成苗率。當(dāng)苗長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，移栽入大田，常規(guī)水肥管理和病蟲害防治。對(duì)處理當(dāng)代即M1代，在開花期對(duì)植株進(jìn)行套袋自交標(biāo)記，果實(shí)成熟后進(jìn)行單株考種。成苗率（%）=（成活的幼苗數(shù)/發(fā)芽試驗(yàn)的總粒數(shù)）×100%。

②光合色素含量的測(cè)定 分別于5月10日，22日摘取葉片進(jìn)行光合色素含量測(cè)定，其測(cè)定方法如下。

a.取西瓜的新鮮葉片0.2 g，用水沖洗干凈后剪碎放入研缽中，加入少量的石英砂和碳酸鈣粉及95%的乙醇2.5 mL，研成勻漿，再加乙醇10 mL，繼續(xù)研磨，至組織變白后靜置3～5 min。

b.取濾紙一張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻璃棒把上述提取液倒入漏斗中，過濾到25 mL的棕色瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?/p>

c.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的光合色素全部洗入容量瓶中，直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。然后用乙醇定容至25 mL，搖勻。

在最初存放車輛時(shí)，可以根據(jù)用戶預(yù)計(jì)的停車時(shí)長(zhǎng)將車輛停放在不同位置，如果在預(yù)計(jì)的時(shí)間內(nèi)取走車輛，則不會(huì)影響整個(gè)車庫(kù)的運(yùn)行效率，如果超過預(yù)計(jì)的停車時(shí)間沒有取走車輛，無疑會(huì)影響車庫(kù)的運(yùn)行效率。因此，可以根據(jù)超過預(yù)計(jì)時(shí)間的長(zhǎng)短將原來停放好的車輛的位置進(jìn)行變動(dòng)，將靠近出入口的車位留給接下來預(yù)存的車輛，以此來進(jìn)一步提高車庫(kù)運(yùn)行效率。

d.把光合色素提取液倒入直徑為1 cm的比色杯內(nèi)，以95%的乙醇為空白，分別在665 nm、649 nm和470 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并根據(jù)吸光值計(jì)算光合色素含量，計(jì)算公式為：葉綠素a含量（Ca）=13.9A665-6.88A649；葉綠素b含量（Cb）=24.96A649-7.32A665；類胡蘿卜素含量（Cx·c）=（1 000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245。

③過氧化物酶活性的測(cè)定 5月22日取葉片進(jìn)行過氧化物酶的測(cè)定，基本步驟如下。

a.取西瓜的新鮮葉片1 g，洗凈、切碎后放入研缽中，加入適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，并將其全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至25 mL，低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

b.酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括：0.05 mol/L磷酸緩沖液2 mL；2%雙氧水1.0 mL；0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1.0 mL和1 mL酶液。以加熱煮沸5 min的酶液為對(duì)照，反應(yīng)體系加入酶液后，立即于34℃的水浴中保溫3 min。后迅速稀釋1倍，470 nm波長(zhǎng)下比色，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄5次，然后以每1 min內(nèi)470 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化為一個(gè)酶活單位來進(jìn)行酶活計(jì)算，過氧化物酶活性=ΔA470×VT/（W×Vs×0.01×t），其中：ΔA470的吸光度為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為材料的鮮質(zhì)量；t為反應(yīng)時(shí)間 （min）；VT為提取酶液的總體積（mL）；Vs為測(cè)定取用酶液的體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜水壓對(duì)西瓜出苗率的影響

由圖1可以看出：對(duì)于萌動(dòng)種子，隨著靜水壓壓力的增大，出苗率均呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，50 MPa平均比對(duì)照降低12%，其中金小蘭和郭牟這2種材料略高于對(duì)照；100 MPa靜水壓下，萌動(dòng)種子的出苗率較對(duì)照低65.4%，略高于半致死劑量；在150 MPa靜水壓下，5個(gè)材料中僅1個(gè)材料出1棵苗，其余全部無苗。

對(duì)于干種子處理，出苗率隨著壓力的升高，不同品種類型之間差異較大，但整體呈降低趨勢(shì)。2個(gè)四倍體品種（蜜玫綠和金玫黑）和1個(gè)小型品種（日本瓜）對(duì)于50 MPa、100 MPa、150 MPa三個(gè)靜水壓劑量反應(yīng)都比較強(qiáng)烈，出苗率比對(duì)照低78.9%以上，金玫黑（四倍體）出現(xiàn)先急劇下降、后緩慢升高再下降的變化趨勢(shì)；而有2個(gè)品種金小蘭（小型瓜）和蜜玫綠（四倍體）處理壓力在100～150 MPa時(shí)，出現(xiàn)成苗率升高之現(xiàn)象。

同一品種材料，在50 MPa、100 MPa靜水壓下，萌動(dòng)的種子出苗率明顯高于干種子，在壓力50 MPa下時(shí)日本瓜萌動(dòng)種子成苗率是干種子的19倍，而在150 MPa靜水壓下，干種子出苗率反而高于萌動(dòng)的種子。

2.2 高壓處理對(duì)西瓜葉片光合色素含量的影響

分別在播種后的第26天和第38天選取日本瓜和蜜玫綠材料的葉片，進(jìn)行光合色素含量的測(cè)定。

經(jīng)高靜水壓處理種子后，西瓜幼苗的光合色素含量因播種后天數(shù)不同而存在差異。高壓處理日本瓜種子（圖2），在播種26 d后，3種光合色素分別為對(duì)照的94.3%，93.6%，94.9%，播種38 d后，分別為對(duì)照的79.3%，97.2%，68.2%；而高壓處理蜜玫綠種子（圖3），在播種 26 d后，3種光合色素含量分別為對(duì)照的99.5%，104%，96.5%，播種38 d后，分別為對(duì)照的97.6%，123.5%，85.2%，隨著播種天數(shù)的增加，處理組與對(duì)照的色素含量均在增加，而處理組 Ca和Cx.c含量分別與對(duì)照組相比，前者增幅小，后者增幅大，但Cb含量卻是處理組比對(duì)照組增幅快。

2.3 高壓處理對(duì)西瓜葉片過氧化物酶活性的影響

圖1 高壓處理對(duì)出苗率的影響

植物在逆境條件下出現(xiàn)的傷害或者植物對(duì)逆境的不同抵抗能力往往與體內(nèi)POD活性水平有關(guān)。高壓處理能增加西瓜材料過氧化物酶的活性，壓力增大，過氧化物酶活性增強(qiáng)。與對(duì)照相比，高壓處理（萌動(dòng)100 MPa）日本瓜的過氧化物酶活性始終高于對(duì)照，最高時(shí)可達(dá)到對(duì)照的16倍左右。高壓處理蜜玫綠（萌動(dòng)50 MPa）的過氧化物酶的活性與對(duì)照相比前2 min明顯高于對(duì)照，分別為對(duì)照的147%，115%，而后2 min則分別比對(duì)照低27.9%，5%。總體來看，高壓處理對(duì)二倍體 （日本瓜）POD活性水平的影響顯著高于四倍體（蜜玫綠）。

2.4 M1代植株的變化（異）類型

播種后不同時(shí)間進(jìn)行出苗率統(tǒng)計(jì)可以看出經(jīng)過靜水壓處理的西瓜種子出苗較為緩慢，且出苗率降低。移栽大田后，高壓處理材料前期生長(zhǎng)受到抑制，后期生長(zhǎng)發(fā)育逐漸與對(duì)照相當(dāng)，隨后出現(xiàn)反超現(xiàn)象。處理的當(dāng)代種子在大田種植過程中，從形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)有各種變異類型。有利變異包括葉片顏色加深、莖蔓粗壯、果實(shí)變大、含糖量增加等；不利變異包括葉子形狀發(fā)生畸變、生育期推遲晚熟、不易坐果、畸形果實(shí)出現(xiàn)等。對(duì)M1代，在開花期對(duì)植株進(jìn)行套袋自交標(biāo)記，果實(shí)成熟后進(jìn)行單株考種，對(duì)其連續(xù)種植，觀察突變或者變異是否能夠遺傳，從而篩選突變株系。

2.5 中心可溶性糖含量的變化

5個(gè)西瓜品種萌動(dòng)和干種子在不同靜水壓50 MPa、100 MPa、150 MPa處理和對(duì)照中心糖含量變化如圖4（由于萌動(dòng)種子在150 MPa處理后沒有成活植株，故沒有萌動(dòng)150 MPa的中心糖含量變化）。從圖4可以明顯看出，在郭牟、日本瓜、金枚黑、金小蘭4個(gè)品種中，經(jīng)過靜水壓處理，均出現(xiàn)了中心糖含量比對(duì)照增加，用SPSS軟件方差分析，這4個(gè)品種的中心糖含量，高壓處理與對(duì)照差異顯著。特別是在金枚黑中，壓力100 MPa處理萌動(dòng)種子，中心糖含量增加10%左右。但是，蜜枚綠卻出現(xiàn)了處理后中心糖含量下降的情況。

表2 西瓜處理組與對(duì)照組葉片的過氧化物酶活性比較

2 高壓處理對(duì)日本瓜光合圖色素的影響

圖3 高壓處理對(duì)蜜枚綠光合色素的影響

圖4 高壓處理對(duì)西瓜中心可溶性糖含量的影響

3 小結(jié)與討論

西瓜種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育過程是一個(gè)復(fù)雜的合成-分解代謝過程，受多種物理、化學(xué)因素的影響。在梯度壓力相同處理時(shí)間下，5個(gè)品種材料均因靜水高壓破壞程度不同或種子活力個(gè)體間存在差異，使部分種子失去活性不能發(fā)芽，部分種子卻能逐漸修復(fù)靜水高壓的破環(huán)作用，最終發(fā)芽，前期生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，后期逐漸趕上對(duì)照，且能結(jié)瓜留種。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與靜水高壓處理破壞了種子的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)。Whelch等[5]認(rèn)為，靜水高壓處理對(duì)于生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性、透性以及細(xì)胞的纖維結(jié)構(gòu)都有明顯的影響甚至破壞作用。王寶山[6]認(rèn)為，逆境脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)抑制常常伴有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，主要由細(xì)胞內(nèi)特別是線粒體或者葉綠體中產(chǎn)生的超氧自由基，·OH-，H2O2等）攻擊膜脂而造成的。但植物體要減少自由基對(duì)其造成的傷害，因此同時(shí)存在著清除這些自由基的途徑。一般情況下，植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但處于逆境中時(shí)，這種平衡狀態(tài)遭到破環(huán)，不能及時(shí)清除的活性氧使細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)氧化脅迫，進(jìn)而引起生物大分子的氧化損傷和生物膜完整性的破環(huán)[7]。過氧化物酶存在于植物體內(nèi)的過氧化物酶體中，是內(nèi)源活性氧清除酶之一，它清除O2·-，生成H2O2，接著把后者水解成對(duì)植物體沒有損害作用的H2O和O2，從而抑制膜脂過氧化，維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性。高壓100 MPa處理日本瓜的過氧化物酶的活性顯著強(qiáng)于對(duì)照，高壓50 MPa處理蜜玫綠的過氧化物酶的活性也明顯高于對(duì)照，這說明高壓處理后的植株抗氧化能力提高，抗逆性增強(qiáng)。

白成科等[8]認(rèn)為，染色體加倍和外源基因的導(dǎo)入，可能與種子的耐壓性降低和突變頻率提高有關(guān)。而本文相同的高靜水壓處理?xiàng)l件對(duì)不同類型西瓜材料種子的成苗率影響不同，二倍體（金小蘭和日本瓜）比四倍體（蜜玫綠和金玫黑）的成苗率高，而四倍體種子的耐壓性低，這也與前人研究的結(jié)果基本一致。靜水高壓處理西瓜種子后，處理當(dāng)代的部分品種在莖稈粗壯（蜜玫綠、金玫黑）、生育遲緩（金玫黑）、含糖量升高（郭牟、日本瓜、金枚黒、金小蘭）等性狀方面發(fā)生了顯著變化，這表明靜水高壓能夠影響西瓜一生的發(fā)育。靜水高壓處理對(duì)西瓜種子萌發(fā)來說是一種逆境脅迫，雖然從萌發(fā)期就解除了這種脅迫，但其影響卻是一直維持到生育后期，從而使西瓜M1代的品質(zhì)和農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯變化。對(duì)M1代變異或者變化植株，要嚴(yán)格自交，單株考種，以便在M2代進(jìn)行觀察研究M1代的變異是否是可遺傳變異，進(jìn)而篩選有利突變植株。

盡管高靜水壓誘導(dǎo)高等植物產(chǎn)生突變的工作已經(jīng)在其他植物上開展了近10 a，但對(duì)于西瓜選育新品種的工作仍處于理論和實(shí)踐的探索階段，因此有必要進(jìn)一步開展高靜水壓誘變機(jī)理的研究，為該方法在植物育種上的成功應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究從選育新品種的角度出發(fā)，利用高靜水壓處理西瓜種子，處理當(dāng)代群體能夠出現(xiàn)一些變異性狀，通過多代“優(yōu)中選優(yōu)”，篩選出綜合性狀優(yōu)良的突變株系，它們具有株型較好、莖稈粗壯、早熟，能育成理化性質(zhì)高、品質(zhì)好的西瓜新品種。從作物育種的角度來看，高靜水壓處理有望成為西瓜誘變育種的新方法。

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Effects of High Hydrostatic Pressure Treatment on the Seedling Growth and Quality of Watermelon

LI Haitao1,SU Lei2,LI Guoshen1
(1.Institute of Agricultural Bio-technology,College of Life Science,Henan University,Kaifeng,Henan 475001; 2.Department of Physics,Zhengzhou University of Light Industry)

The effects of high hydrostatic pressure treatment(50 Mpa,100 Mpa,150 Mpa)on the planting percent,chlorophyll contents,peroxidase and quality of watermelon were studied.The results showed that the planting percent in treated group decreased in comparison to the control group and T-test indicated the difference is significant in the believable level of 95.The contents of chlorophyll and carotenoid in the treated group is less than that of the control group,while the activity of peroxidase and adversity resistance in the treated group is more than that of control group.It showed that high hydrostatic pressure treatment can inhibit the growth of watermelon at the early stage and enhance the adversity resistance and the quality of watermelon at the later stage.

Watermelon;High hydrostatic pressure;Photosynthetic pigment;Activity of peroxidedase

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.10.016

河南省鄭州市金水區(qū)科技項(xiàng)目（金科字[2008]18號(hào)），河南省教育廳攻關(guān)項(xiàng)目（2008A208002）

李海濤（1980-），男，在讀碩士，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種，電話：13837813116，E-mail：shirenshan@163.com

李國(guó)申（1957-），男，通信作者，研究員，E-mail：lgs@henu.edu.cn

2010-04-21