胃癌的表觀遺傳學研究進展

彭小春 (長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

魏 蕾 (武漢大學醫學院，湖北 武漢 430071)

胃癌的表觀遺傳學研究進展

彭小春
(長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

魏 蕾
(武漢大學醫學院，湖北 武漢 430071)

胃癌的發生發展是一個涉及多基因多步驟的復雜過程，包括遺傳機制以及表觀遺傳學修飾兩個方面。表觀遺傳學修飾在胃癌發生過程中的作用越來越受到重視。異常甲基化通過影響基因轉錄，促基因突變，增加染色體結構的不穩定性等多方面促進胃癌的發生發展。組蛋白的乙酰化影響著抑癌基因的轉錄，從而在胃癌的發生進展中發揮著重要作用。

胃癌；表觀遺傳學；DNA甲基化；組蛋白修飾

表觀遺傳學是指研究非DNA序列變化引起的、可遺傳的基因表達改變。表觀遺傳學的研究對象不是基因組核苷酸序列所攜帶的遺傳信息，而是研究基因表達在時間和空間上的調控問題，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印跡、染色體重塑、基因表達重新編程、X染色體失活等，其中最主要的兩個研究內容是DNA甲基化和組蛋白修飾。胃癌的發生發展是多因素、多階段、多基因共同作用的結果，研究表明胃癌的表觀遺傳學改變在胃癌進展過程中發揮著重要作用。

1 DNA甲基化與胃癌

1.1DNA甲基化DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上并與其3’端的鳥嘌呤形成mCpG，且在雙鏈對稱出現。甲基化特征的遺傳主要是通過維持性甲基轉移酶(maintenance methyltransferase)實現的，其特點是以雙鏈中互補鏈為甲基化CG的CpG作為底物，從而保證在子代細胞中有可能恢復親代的甲基化狀態。DNA甲基化異常可分為甲基化增強、甲基化減弱和甲基化酶水平增高三種類型，其中甲基化增強在腫瘤中最常見，與腫瘤的關系比較明確，被認為是腫瘤抑制基因失活的重要途徑，研究取得的進展也最多。癌基因多為不充分甲基化，導致重新開放或異常表達；抑癌基因多為過度甲基化，從而表達受抑制，DNA異常甲基化導致腫瘤發生的可能機制如下。首先，在正常情況下非甲基化的CpG島的高甲基化，可以導致腫瘤抑制基因的失活。其次，DNA甲基化可以促進腫瘤相關基因的突變，因為5-甲基胞嘧啶可自發或在S-腺苷蛋氨酸的作用下引起鄰位脫氨而變為胸腺嘧啶，使甲基化的CpG突變為TpG，這是最常見的突變，在抑癌基因p53中也最常見，是腫瘤相關基因甲基化促進細胞惡變的一種機制。近年來胃腸道腫瘤相關基因的研究集中在相關基因啟動子區域CpG殘基的高甲基化，特別是抑癌基因的研究目前已成為熱點。

1.2DNA甲基化與胃癌發生目前研究發現多種基因的甲基化異常與胃癌的發生有關，根據甲基化變化的程度可以分為：①僅在胃癌發生甲基化如GSTP1和RASSF1A基因；②在慢性胃炎、腸上皮化生以及胃腺瘤出現低甲基化的頻率高而在胃癌出現高甲基化的頻率高如COX-2、hMLH1和p16基因；③在胃癌發生發展的各個階段表現為相似頻率的低甲基化如MGMT基因；④在胃癌發生發展的各個階段表現為相似頻率的高甲基化如APC和E-cadherin基因；⑤隨著胃癌的發展表現為甲基化不斷增高的趨勢如DAPK，p14，THBS1和TIMP-3等基因。

RASSF1基因定位于染色體3p21.3，是RAS相關基因，至少以兩種形式在正常人細胞中表達，但在胃癌的癌變過程中僅RASSF1A表觀性的滅活。且進一步研究發現RASSF1A的滅活與K-ras的激活是癌變過程當中互相對立的事件，這提示RASSF1A應該是腫瘤細胞凋亡信號通路中K-ras的一個抑制物，RASSF1A的重表達抑制了胃癌細胞的生長，可以證實RASSF1A是腫瘤的抑癌基因[1]。

hMLH1是一種DNA錯配修復基因，與癌基因和抑癌基因一樣在致瘤過程中起關鍵作用，它的突變或表達降低會增加受損傷細胞中DNA的突變頻率，不僅導致癌基因和抑癌基因的突變率增高，還可導致微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)的發生。Fleisher等檢測了65例胃癌的hMLH1甲基化情況與MSI的關系，發現其中18例胃癌有多個微衛星位點突變，為高頻率微衛星不穩定性(MSI-H)；8例胃癌僅有1個微衛星位點突變，為低頻率微衛星不穩定(MSI-L)；39例胃癌無微衛星位點突變，為微衛星不穩定性陰性(MSI-陰性)。結果顯示：77.8%的MSI-H胃癌發生hMLH1基因的甲基化；75%的MSI-L胃癌發生hMLH1基的甲基化；僅23%的MSI-陰性胃癌有hMLH1基因的甲基化。而且，發生hMLH1基因甲基化的胃癌僅表達少量的hMLH1蛋白，而未發生hMLH1基因甲基化的胃癌表達豐富的hMLH1蛋白[2]。這些數據表明：hMLH1基因甲基化可導致DNA錯配修復缺陷，并且與胃癌的MSI密切相關。 Leung等的研究不僅證實hMLH1基因甲基化與胃癌MSI-H密切相關，還證實hMLH1蛋白的丟失與浸潤性腫瘤的發生密切相關。還發現隨著年齡的增加，hMLH1甲基化的頻率顯著增加，提示其在老年人胃癌的發生過程起著重要作用[3]。 Kang等研究發現hMLH1甲基化可能包含在早期胃癌發展過程中，如hMLH1甲基化在癌組織中出頻率為42.2%，比腸化生2.1%和腺瘤11.5%更頻繁。研究表明，hMLH1在慢性胃炎、腸化生、胃腺瘤和胃癌的甲基化頻率逐漸升高，反映了癌的變化過程[4]。

MGMT(Methylguanine DNA methyltransferase)定位于染色體10q26，編碼甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶，是一種DNA修復蛋白，可對烷基化合物損傷的DNA進行修復，而研究發現胃癌由于其甲基化頻率低以致于MGMT表達較高，對烷基化療藥物不是很敏感[5]。

研究發現APC/E-cadherin信號通路的失活在胃癌的發生進展中起著重要作用，其中APC基因是位于5q的抑癌基因，其蛋白參與修飾轉錄活化和細胞周期的調節。通過對胃癌APC基因的分析發現：用特異化甲基PCR(MSP)對胃癌標本和胃癌細胞株的分析發現：82.5%的原發性胃癌，97.5%胃癌患者的癌旁胃黏膜和10個胃癌細胞株APC啟動子1A呈高甲基化，而啟動子1B卻沒有發生甲基化。由于甲基化，在10個細胞株中，外顯子1A沒有出現APC表達，而外顯子1B卻出現APC表達。說明APC啟動子1A甲基化在胃癌形成的早期就出現，可成為有用的生物標記[6]。有研究表明：APC在慢性胃炎、腸化生、胃腺瘤和胃癌中的甲基化頻率均較高，在腸化生中可高達80.7%，這說明它可能是胃癌發生的早期事件。E-cadherin在胃癌中的表達與腫瘤的浸潤、轉移呈負相關。在約50%的未分化型胃癌中，E-cadherin有突變，從而被滅活。Tamura等的研究顯示，E-cadherin基因啟動子的甲基化可導致其表達降低，而且發生于胃癌的早期，他們用甲基化特異性PCR-SCP及直接測序PCR產物的方法，來研究E-cadherin基因啟動子的甲基化情況，該技術可以檢測出啟動子內所有被甲基化的胞嘧啶。對53例原發性胃癌檢測結果顯示，51%的胃癌有甲基化，未分化型胃癌的甲基化率(83%)明顯高于其他組織類型的胃癌(34%)；早期胃癌與進展期胃癌的甲基化率相似，對4例進展期胃癌和2例早期胃癌的DNA經硫化處理后進行了測序分析，發現這6例胃癌的E-cadherin基因，在靠近轉錄起始部位的CpG均發生甲基化，經Western印跡雜交檢測，證實有4例腫瘤的E-cadherin蛋白表達消失或明顯減少[7]。因此可見， E-cadherin基因啟動子的甲基化與胃癌密切相關。

p14INK4a/ARF(CDKN2A) 定位于染色體9p21，編碼2種不同的蛋白質，一個為細胞周期依賴性激酶抑制劑p16INK4a；另一個產物為其可變讀框基因(alter ativereading frame，ARF)編碼，產生一個由132個氨基酸組成Mr1390的P14蛋白，p14蛋白能穩定和提高細胞p53水平，增強p53在G1S期和G2M期的限制點效應，最終使細胞阻滯于G1期和G2期。因此p14屬于腫瘤抑制基因，具有顯著的細胞周期負調控作用。目前認為，惡性腫瘤中p14主要由于p14啟動子甲基化而失活。 Iida等發現擴散型胃癌p14啟動子甲基化率45.5%。同時，因p14啟動子甲基化而失活者，在細胞質中可以發MDM2(murinedoublegene 2)，而且p53表達失活，用去甲基化試劑處理后，MDM2又回到細胞核而且p53也表達[8]。Esteller等對胃癌細胞株的分析發現，7個細胞株中有5個不表達p14 mRNA，對不表達者進一步分析，發現其啟動子高甲基化。有研究表明：p14在胃腺瘤和胃癌中的甲基化頻率比在胃炎和腸化生中明顯升高[9]。

還有些基因的異常甲基化與胃癌有關。CD44 基因定位于染色體11p13，長約50～60kb，由兩組外顯子(1～20) 組成。一組(由外顯子1～5 和16～20 組成) 共同剪切形成轉錄體，稱為標CD44(CD44s)。它編碼產生標準型CD44蛋白。另一組為10個變體外顯子6～15(v1～v10) 選擇性剪切，在5～16外顯子之間的一個插入位點插入一般的外顯子。含有v 區外顯子的CD44 轉錄子統稱為變異型CD44(CD44v)，它編碼產生變異型CD44 蛋白。研究表明CD44表達與胃癌發生發展密切相關，CD44基因的異常往往影響CD44蛋白的表達。Satos等通過Northern blotting和RT-PCR技術檢測8種胃癌細胞系，發現僅MKN-28細胞系未表達CD44，進而研究發現主要是由于CD44基因啟動子區域發生甲基化而抑制了CD44的表達[10]。抑癌基因RUNX3是調控細胞生長信號通路的重要調控因子，研究表明DNA的高甲基化導致其表達過少可能是參與胃癌進展的重要因素[11]。研究發現通過測定來源于42個胃癌患者的組織和8個細胞系中RARbeta、CRBP1和TIG1三種基因的情況，發現7個胃癌細胞系CRBP1基因發生甲基化且CRBP1轉錄取失活，6個胃癌細胞系TIG1基因甲基化且TIG1轉錄取失活利用5-aza-2’-脫氧胞苷酸治療可以恢復兩者的轉錄；42例胃癌標本中RARbeta、CRBP1和TIG1基因的甲基化分別為15例(36%)、14例(33%)和4例(10%)，而在癌旁組織中分別為6例(20%)、0例和1例 (3%)，10例來源于正常健康的年輕人的胃黏膜組織中三個基因均未發現甲基化[12]。研究發現感染幽門螺旋桿菌的非腫瘤胃粘膜中p16， Ecad和DAPK基因的CPG島高甲基化患胃癌的危險性顯著增大[13]。pS2定位于第21號染色體，含有3個外顯子和2個內顯子，編碼一含有信號肽的84個氨基酸的多肽，成熟后為一個60個氨基酸的分泌型胞外多肽。pS2主要分布在胃腸道的黏液分泌細胞，維持黏液分泌穩定。pS2在胃腸道黏膜受到急性損傷時表達增高，刺激胃腸道黏膜細胞的增生、修復、維護胃腸道黏膜的屏蔽作用。pS2曾被認為是胃癌特異的腫瘤抑癌基因，Fujimoto等檢測了胃癌、腺瘤和非腫瘤性黏膜的pS2啟動子的甲基化情況，結果顯示：其主要發生在分化好的胃癌和腸化生黏膜中，發生pS2甲基化的胃癌不表達pS2蛋白。因此他們認為，pS2啟動子甲基化參與早期胃癌的發生[14]。

1.3DNA甲基化與胃癌診斷某些基因DNA甲基化在胃癌細胞中表達水平異常，可能是胃癌發生發展分化程度的標志。研究發現p16基因在胃癌組織和血清中甲基化為44.2%和26.9%，且p16蛋白的表達減少和p16基因的甲基化正相關，提示血清中p16基因甲基化檢測可能是早期發現診斷胃癌的重要分子標志物[15]。Oue N等通過對75例胃癌標本中12個腫瘤相關基因甲基化分析，發現高甲基化在Ⅲ/Ⅳ期胃癌出現的頻率(26/40，65.0%)比Ⅰ/Ⅱ胃癌 (13/35，37.1%，P= 0.029)高，可以作為對胃癌臨床分期診斷重要的標準[16]。鈣粘蛋白家族的一個基因CDH4 (編碼R- cadherin)，在95%的胃癌中發生甲基化，且在腫瘤新生物附近的正常組織也發生了甲基化， 可以說明CDH4甲基化是胃癌發生的一個早期事件。同時證實胃癌患者的外周血中可以檢測到CDH4甲基化[17]，因此可以設想CDH4是胃癌的一個抑癌基因，可以作為胃癌早期診斷重要的標記分子。

1.4DNA甲基化與胃癌的治療和預后學者已經在細胞水平上使甲基化的基因再活化，從而改善細胞的功能，然而發現對于人體治療還難度很大。原因是使用DNA去甲基化的藥物是非特異性的，如5-aza-cytidine或5-aza-2,deoxycytidine 抑制了DNA甲基轉移酶而導致總體的低甲基化水平，不能對特定的基因產生作用。另外一個原因是大劑量的去甲基化藥物不僅殺傷腫瘤細胞，對正常的細胞也有毒性作用。雖然這些藥物有其弱點，但還是在臨床上應用這些藥物治療骨髓增生異常綜合征及急性髓性白血病上取得了成功。而在胃癌方面，有學者測定了胃癌患者腫瘤和外周血基因的異常甲基化，p16甲基化的出現率分別為66.7%和51.9%，而正常對照為陰性。結果表明血清中基因異常甲基化能如實的反映腫瘤中基因異常甲基化的情況，可作為胃癌患者的治療篩選指標。另外，研究發現利用去甲基化藥物處理胃癌細胞，使其R-RAS癌基因的第一個內含子的特異性CpG位點去甲基化從而使得R-RAS活化，參與了胃癌的發展。R-RAS表達沉默的胃癌細胞會導致其粘附性降低，這說明通過藥物治療抑制R-RAS信號通路是治療胃癌很好的途徑[18]。相信不遠的將來，更有效的去甲基化藥物的開發會給胃癌的治療帶來希望。

2 組蛋白與胃癌

在真核生物中，染色質由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成，其中組蛋白是真核細胞中特有的成分，富含帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，可以與帶有負電荷的DNA分子緊密結合。組蛋白的N2末端可通過乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化、ADP核糖基化等進行翻譯后的修飾，這些修飾信息稱為組蛋白密碼，其中以組蛋白乙酰化與腫瘤發生有著最為密切的聯系。組蛋白的乙酰化被認為在轉錄子的調控中發揮著重要作用，而組蛋白去乙酰化導致抑癌基因轉錄阻滯從而在腫瘤中發揮著作用。p21(WAF1/CIP1) 是一種抑癌基因，研究發現胃癌標本中該基因的啟動子區域組蛋白H3去乙酰化，且此去乙酰化與p21(WAF1/CIP1)蛋白低表達呈正相關。進而利用染色質共沉淀方法對29例胃癌標本檢測，發現p21(WAF1/CIP1)啟動子與編碼區域中組蛋白H3去乙酰化均為10例(34.5%)。p21(WAF1/CIP1)啟動子與編碼區域中組蛋白H4去乙酰化分別為6例(20.7%)和16例(55.2%)。p21(WAF1/CIP1) mRNA 水平與p21(WAF1/CIP1)啟動子區域組蛋白H3乙酰化狀態呈正相關(P= 0.047)。在胃癌細胞系中加入組蛋白去乙酰化阻滯劑曲古抑菌素A，發現可以促進p21(WAF1/CIP1)蛋白的表達。并且發現p21(WAF1/CIP1) 啟動子區域組蛋白H3的超乙酰化與其蛋白表達正相關，而跟組蛋白H4的超乙酰化無關；但p21(WAF1/CIP1)編碼區的組蛋白H3和H4的超乙酰化都能促進蛋白的表達[19]。這說明組蛋白的乙酰化水平影響著抑癌基因p21(WAF1/CIP1)的表達從而參與胃癌的進展。有學者發現，SLC5A8基因的H3組蛋白的去乙酰化以及PINX1基因5’ UTR區域組蛋白H4去乙酰化影響SLC5A8和 PINX1的表達，從而在胃癌中發揮著作用。有學者將曲古抑菌素A作用于胃癌細胞系SGC-7901，發現可以抑制胃癌細胞生長和誘導凋亡，進而研究發現主要是通過調控如Bcl-2，Bax 和survivin等凋亡相關基因，并不是通過激活經典的半胱天冬酶凋亡信號途徑[20]。為了進一步提高胃癌的化療效果，研究人員將組蛋白去乙酰化抑制劑(TSA)，胃癌細胞系OCUM-8 和MKN-74以及抗癌藥物如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奧沙利鉑 (OXA)、依立替康(SN38) 和吉西他濱(GEM) 共同培養，發現可以顯著提高化療效果。同時發現經TSA處理過的胃癌細胞系中p21、 p53、DAPK-1和DAPK-2高表達。這說明TSA和抗癌藥物5-FU、 PTX及SN38聯合應用治療胃癌很有前景，其主要機制可能和TSA的協同效應引起的p21、p53、DAPK-1 和DAPK-2上調表達有關[21]。

表觀遺傳學與胃癌的發生發展如此密切，且表觀基因改變是可逆的，能被治療劑所逆轉甚至可通過飲食預防，因此相信不久的將來會更廣泛地應用到臨床。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.030

R730.23；R735.2

A

1673-1409(2010)03-R065-05