軟骨發育不全的產前診斷進展

朱 泓，楊祖菁

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院婦產科，上海 200092)

軟骨發育不全的產前診斷進展

朱 泓，楊祖菁

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院婦產科，上海 200092)

軟骨發育不全是最常見的遺傳性侏儒，作為一種嚴重的遺傳性疾病，該病發生后難以治療。近年來，由于產前診斷方法及分子生物學診斷技術的發展，軟骨發育不全的產前基因診斷成為可能。本文就該病的產前診斷技術尤其是基因診斷這方面進展進行綜述。

軟骨發育不全;胎兒;基因診斷

軟骨發育不全(Achondroplasis，ACH)是人類骨骼發育異常中常見的類型，又稱胎兒型軟骨營養障礙(Chondrodystrophia fetalis)，其基本病理變化是骨骺生長板區軟骨細胞的生長及成熟發生障礙，導致軟骨內成骨障礙［1－3］。其基本的病理改變發生在軟骨化骨過程［4］，從胚胎內開始骨化時即已出現，骨骺軟骨細胞可發生增殖，但不進行正常的鈣化與骨化。臨床表現主要為個體矮小，頭大，前額圓凸;鼻梁下陷，上頜骨發育不良，隨年齡增長而更趨明顯。我國ACH的發生率為18/100萬，圍產期死亡率為1/10萬［5］，該病外顯率為100%，完善產前診斷技術將大大減少此類缺陷兒的出生。

1 遺傳概況

ACH的發病與遺傳有密切關系，為常染色體顯性遺傳。純合子患者的子女100%發病，雜合子患者的子女發病概率為50%。由于不少病人不結婚或難產，致使無下一代，因而影響到遺傳形式。有統計顯示80% －90%的病例沒有家族史，為散發性病例，實際上是一種基因突變的結果。臨床觀察表明，父親年齡大者生育軟骨發育不全患兒的機率明顯升高，故認為其基因突變只發生在父系染色體，往往在受精之前即已發生，在精子發生過程中影響DNA復制和修復的因素，會增加基因突變的發生率［6］。但是，Tiemann等［7］專門研究了男性精子細胞的基因突變，發現與年齡并無明顯相關性。也有觀點認為，任何可能導致基因改變的外界因素都有可能導致軟骨發育不全的發生，如接觸紫外線、X射線、致突變的化學物質等。

2 ACH與FGFR3基因突變的關系

在不斷的研究過程中，人們對軟骨發育不全(ACH)有了逐步深刻的認識。Shiang等［8］將ACH的致病基因定位于4號染色體短臂t末端，不久Rousseau等［9－10］幾乎同時發現成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)跨膜區基因第1138位核苷酸的突變是ACH發病的原因。FGFR3有19個外顯子和18個內含子，其中第10外顯子編碼FGFR3跨膜區以DNA測序發現，絕大多數的突變是第1138位核苷酸G—A堿基轉換，少數為G—C轉換，這兩種突變都導致了FGFR3跨膜區第380位密碼子的錯義突變(甘氨酸 Gly 替換為精氨酸 Arg)［8－10］，是骨關節先天畸形中發生基因突變率最高的。FGFR3在骨骼發育初期的軟骨中表達水平最高，FGFR3與配體FGF結合后，引發耦聯和自磷酸化作用，通過干擾軟骨細胞的增生和分化抑制軟骨化骨過程。FGFR3跨膜區基因1138位核苷酸突變后［11－13］，引發 FGFR3功能持續地、不依賴配體地激活，甚至在飽和濃度的配體中，突變的受體也拒絕配體介導的調控。這導致FGR3對骨骼生長的負向調節作用失控。近年另有學者分別在歐洲和日本ACH患者中發現了FGFR3基因1123位G—T顛換，導致375位密碼子的突變，即由半胱氨酸代替了甘氨酸，表明ACH與其他遺傳性疾病一樣存在著等位基因的異質性。

3 產前影像學診斷

ACH的產前診斷常常是通過孕中、晚期的超聲檢查來診斷，B超下可見［14－15］胎兒頭大、短的股骨、脛骨和腓骨，三叉形態的和“古鐘”樣胸腔，胎兒腹部膨隆，腹圍增大，胎兒四肢短小，長管骨短粗且伴有彎曲，骨端膨大;羊水量增多。通過測定胎兒各長骨的長度、雙頂徑、頭圍、胸圍、腹圍、心/胸比值、足底長度等參數，觀察骨的長度、形態及骨化程度，可對約31%－39%的某些特定類型病例做出診斷。對于孕周確切的胎兒，長骨測量值低于預測值兩倍標準差以上時應考慮胎兒有軟骨發育異常。超聲對先天畸形的檢測有較高的診斷價值，是初步篩查軟骨發育不全的理想方法，但僅能在孕中、晚期進行診斷，故也有一定的局限性。

在實際工作中，當胎兒骨骼畸形的形態改變在二維超聲中不十分典型或者相互雷同時，最好用三維超聲來確診，在三維超聲中，可見胎兒五官分布不協調，眼距稍寬，鼻梁稍塌，四肢短而彎曲，以近端長骨短為主，軀干長度正常，與四肢不成比例。三維超聲可以明顯地提高圖像的時間和空間分辨力，Krakow等［16］認為三維超聲成像技術比普通的產科B超更容易發現異常。

宮內三維螺旋CT、MRI可在先天性骨骼發育異常的產前診斷中發現更多的異常征象，是對二維超聲檢查的有益補充。

4 產前基因診斷

4.1 胎兒DNA采集

4.1.1 母體血中富集胎兒DNA 長期以來，研究者一直試圖找到一種安全、可靠、對胎兒無任何損害的產前診斷方法。Saito等［17］用B超檢查1例妊娠婦女，懷疑其胎兒患有軟骨發育不全。為進一步證實，將PCR技術與限制性片段多態性法相結合，擴增并分析血漿中胎兒的成纖維細胞生長因子受體3基因片段，結果證實該片段上的1138位點上的G為A所取代。盡管胎兒細胞存在于母體外周血中已被許多學者所證實，但是由于其數量少、個體差異及不同妊娠周的含量不同，使其難以成為臨床實用的非創傷性產前診斷的檢測方法。現在，利用母血漿中的胎兒DNA進行產前診斷還在實驗室階段。若要從實驗室走向臨床，尚需解決的問題有:首先必須改進從血漿中提取胎兒DNA的方法以獲得高產量、高濃度的DNA模板;其次必須簡化檢測的環節，盡量早日實現自動化，以減少檢測操作過程中的污染。

4.1.2 超聲引導下經皮臍靜脈穿刺 超聲引導下經皮臍靜脈穿刺術獲取純胎兒血標本，再從胎兒血中提取DNA，對快速胎兒染色體核型分析、基因異常、胎兒遺傳代謝缺陷等有診斷價值，是其他方法無法比擬的。但因其為入侵性的產前診斷方法，應正確掌握指征，避免對母體及胎兒的損傷。提高手術的成功率及安全性，是普遍推廣應用的關鍵。為此必須高度重視超聲引導下經皮臍靜脈穿刺術的原則。

4.1.3 絨毛活檢術 絨毛活檢術(Chorionic villus sample，CVS)給胎兒的遺傳研究提供了可靠的研究材料。在孕早期細胞生長活躍時通過組織培養迅速獲得較羊水更多的細胞，從而可以更早期、準確地實現產前診斷。標本可直接用于細胞染色體核型分析或培養后進行生化或基因圖譜［18］。Antoniadi等［19］用此方法對包括軟骨發育不全在內的多種遺傳病進行了基因診斷，并認為如果操作規范這是避免來源母體DNA污染標本較好的方法。但妊娠丟失率較高，始終是臨床頗感棘手的顧忌。

4.1.4 羊水細胞培養 目前，羊水細胞培養采用實時超聲監測引導技術，使穿刺準確性提高，并且穿刺針的管徑較小，可能降低胎兒流失率，是目前臨床常用的方法。然而，由于羊水中活細胞少，培養周期長，無菌要求高，稍不注意就會失敗，即使培養成功，因分裂相少，形態不佳，達不到分析要求，無法進行進一步研究，如熒光原位雜交技術(FISH)等［20］，使羊水產前診斷的應用受到限制。

4.1.5 胚外體腔穿刺術 胚外體腔穿刺術是指孕早期在B超引導下，用穿刺針刺入孕囊內的胚外體腔，抽取液體用作產前診斷的一項新技術［21－22］，是目前可以開展的較早的產前診斷取材技術。胚外體腔穿刺術不穿破羊膜，可避免羊水滲漏的發生及對胎兒的直接損害;不損傷絨毛，與絨毛活檢相比，可減少繼發胎兒畸形的發生率;胚外體腔細胞來自胚外的中胚層，較少遇到假嵌合體問題。據報道，胚外體腔液中含有豐富的蛋白質、維生素、微量元素等［23－24］，抽取體腔液是否再生、體腔液的缺失是否對胎兒有遠期影響，抽取體腔液的量與胎兒的近遠期安全性的關系，仍需進行大樣本、孕晚期、出生后的對照研究等。

4.2 基因診斷

4.2.1 PCR－單鏈構象多態性分析(Single strand conformation polymorphism，SSCP)ACH 最常見的1138位G—A突變可被限制性內切酶SfeI檢測出，抽提軟骨發育不全患者的DNA，PCR擴增含有FGFR3基因高發突變位點G380R區域，將PCR產物直接用限制性內切酶SfeI消化，15%PAGE凝膠電泳。電泳檢測結果是軟骨發育不全患者將出現正常PCR產物條帶及其被內切酶消化后的兩條帶(109bp和55bp兩條DNA片段)，而患者父母及正常人僅出現PCR產物相同大小單條帶(l64bp的DNA片段)。PCR—限制性酶切法已成為檢測這一已知最常見點突變的有效方法。但是，SSCP的檢測條件可因DNA片段長度及核苷酸組成有較大差別，電泳條件可因突變類型不同而各異，故較難掌握;另外，可因加量不適當導致多態性條帶，與正常條帶重疊不易判斷;另外還可由于變性不徹底而出現雙鏈，特別是異源雙鏈的干擾而影響實驗結果的準確性［25］。

4.2.2 基因測序 FGFR3是ACH的致病基因，該疾病的發生99%以上是由于FGFR3基因第1138位核苷酸的G－A堿基轉換或G－C堿基顛換(前一種突變占絕大多數)引起，這兩種點突變均導致由該基因編碼的成熟蛋白質的第380位的甘氨酸被精氨酸替代(G380R)［8－10］。對于有條件的實驗室，可以直接通過對PCR產物的基因測序來檢測FGFR3跨膜區基因的突變，將測序結果和正常基因序列對照，若能發現第1138位核苷酸發生G－A或G－C的堿基轉換則可確診為軟骨發育不全，若與正常序列相同則可完全排除。由于基因測序尚不能保證100%的準確性，故應取不同PCR產物從兩端分別進行測序才能確診。

4.2.3 基因芯片技術 基因芯片(Gene chip，DNA chip，DNA microarray)將大量的核酸分子同時固定在載體上，一次可檢測分析大量的 DNA和RNA，解決了傳統核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目標分子數量少、成本高、效率低等的缺點［26］。Pinar等［27］研制出診斷軟骨發育不全的電化學芯片，并成功地用于軟骨發育不全的基因診斷。基因芯片診斷不但可以明確有無突變，而且能明確突變類型，高密度芯片診斷能達到與基因測序一樣的準確性，并且能夠明確患者是雜合子還是純合子，產業化的芯片相對基因測序也更易于普及。目前，該技術在軟骨發育不全的基因診斷領域已顯示出重要的理論和應用價值。

4.2.4 胚胎植入前診斷 植入前遺傳學診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)在胚胎植入子宮前進行診斷，經檢測胚胎無待測的遺傳缺陷時才被植入子宮。Rechitsky等［28］已經成功地開展了軟骨發育不全的PGD。但是，因為軟骨發育不全80%以上無家族史，僅對患者進行PGD是不安全的，確保無任何遺傳病變嬰兒的出生，是產前診斷的最終目標。對每例移植胚胎均在植入前進行軟骨發育不全的突變篩選才是最安全的。

5 展望

軟骨發育不全畸形兒的出生給產婦及其家庭造成了巨大的心理和生理痛苦，為避免畸形兒出生，產前診斷已廣泛用于圍產期保健。提高先天性軟骨發育不全的產前診斷是廣大婦產科工作者的重要任務，也是提高我國優生優育水平的重要措施。我們建議將產前超聲檢查作為常規篩查，發現胎兒肢體短小時，應行胎兒染色體檢查，排除染色體畸變，如21三體兒、18三體兒往往出現長骨短小。對于疑為先天性骨骼發育異常的胎兒，產前超聲檢查常難以確定其特定類型，對胎兒遺傳物質的基因診斷是確診的最佳標準。而軟骨發育不全的胚胎植入前診斷將是軟骨發育不全夫婦生育健康后代的希望。

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R681.1

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1003—6350(2010)09—118—04

朱 泓(1979—)，女，上海市人，主治醫師，碩士。

2010－03－05)

·調查研究·