分子生物學技術在病原真菌鑒定中的應用

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑等藥物的廣泛應用，真菌感染性疾病不斷增多，故而其菌種鑒定在臨床診斷、治療中起著重要指導作用。真菌感染的診斷以往主要以形態學為依據，但這些方法費時費力，并且檢測陽性率很低；目前飛速發展的分子生物學技術為病原真菌的生物學特性研究提供了可能，本文對這幾種分子生物學技術的特點及在病原真菌鑒定分型研究中的應用進行綜述。

1 多聚酶鏈式反應(PCR)

PCR技術是一種特異擴增DNA的體外酶促方法，可用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA。而改進的PCR技術如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR(mutiplex PCR)、熒光PCR技術等則又在較大程度上增加了該技術的敏感性與特異性。近年來，PCR方法已滲透至臨床檢測的各個領域，并逐漸應用于真菌病的診斷中。

根據真菌的保守序列設計通用引物，用常規PCR方法進行擴增，判定感染真菌的種類則需應用屬種的特異性引物。前者最常選用的靶基因是核糖體蛋白基因（rDNA），其亞基序列（18S和28S）相對保守，多用于設計真菌通用引物，比較成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9等；后者則根據兩個相對變異的內轉錄間隔區（ITS1和ITS2），或特異基因設計而成，直接鑒定至種，常用引物有ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等。

Turenne[1]等采用熒光標記引物擴增種特異性ITS-2，結果證明對獲自血液和組織的致病性真菌種水平上的區分有極好的效果。有國外學者用多重PCR測定法鑒定口腔念珠菌屬，采用引物ITS1，ITS2，CA3和CA4進行檢測，結果能準確檢測出所有樣本菌，比培養法準確。說明多重PCR是一種檢測假絲酵母屬的快速方法[2]。

2 聚合酶鏈反應-限制性片斷多態性分析(PCR-RFLP)

又稱限制性內切酶分析（REA），是指用限制性內切酶將DNA在特定的核苷酸序列上切割，由于不同生物個體酶切位點不同，故產生的DNA片段長度呈現多態現象，根據這種DNA的多態性圖譜可進行種間和種內分型。原則上，只要內切酶選擇合適，對所有真菌均能顯示任何分類水平上的多態性和特異性。

Denning[3]等用該法對肺曲霉病患者體內分離的煙曲霉進行了DNA分型，結果提示多種類型的曲霉病可能由同一DNA型的煙曲霉引起，并且發現致病性煙曲霉菌群的分布與人類生活環境和自然環境密切相關。PCR-RFLP技術雖然快速、靈敏，但當檢測的真菌較多時，由于單種限制性內切酶不能區分所有真菌，需要幾種內切酶的聯合使用，較耗時費力。

3 隨機引物擴增 DNA多態性(RAPD)技術

又稱任意引物聚合酶鏈反應(arbitrarily primed PCR)，RAPD技術是利用隨機合成的單個寡核苷酸為引物（通常為10bp），通過PCR擴增靶細胞基因組DNA片段進行多態性分析，來比較不同個體基因組DNA組成的差異，進行基因定位，確定基因型，做出DNA指紋圖等。這一方法適于病原真菌各秩級的分類與鑒定研究，因為病原真菌基因組龐大，目前許多基因操作技術只能了解其局部的情況，而RAPD卻能對整個基因組序列作大致的了解。RAPD借用的基本方法是PCR技術，無需模板DNA的任何序列信息，不需對擴增產物進行酶切與測序，無需DNA探針，不涉及Southern雜交、放射自顯影或其他技術，操作步驟少，實驗周期短，能在較短的時間內篩選大量樣品。但其重復性和特異性往往受反應條件的制約。該法可以在未知靶DNA序列的情況下進行，特別適用于分子生物學特征不明確或不了解基因組DNA序列的真菌，因此被廣泛用于酵母菌和絲狀真菌的分類和流行病學研究。

4 DNA序列分析

DNA序列分析能夠獲得DNA分子變異最本質、最可靠的信息，對于了解基因結構、表達及分子進化等具有重要意義。以DNA為對象的研究均是建立在基因序列差異的基礎上，所以DNA序列分析是分子生物學研究中最根本的方法。該方法可用于設計探針、特異引物等對真菌病進行診斷。

真菌基因組中編碼核糖體的基因有4種:18SrDNA、5.8SrDNA、28SrDNA、5SrDNA[4]。包括18 SrDNA入與5.8SrDNA間的內轉錄間隔區1(internal-transcribed spacer-1,ITS-1)，5.8SrDNA與28SrDNA間的內轉錄間隔區2(internal-transcribed spacer-1，ITS-2)。一般編碼區的序列較保守，而內轉錄間隔區（ITS）進化較大，在一個屬內不同種間變異較大，對鑒定真菌菌種是有價值的。選擇rDNA的ITS區域是當前進行種間分類和種系發生關系最可靠的編碼區。

Makimura[5]根據ITS的序列分析建立了種系發生樹，將毛癬菌屬分為3群，并指出過去對皮膚癬菌的分類過細，而以種系發生關系的基因型劃分與傳統的分類方法有很大的區別，需要大量的進一步的研究來統一種系發生關系的基因型劃分。然而，盡管測序可獲得最準確最可靠的分類資料，但此技術對DNA的量和純度要求較高，儀器設備價格昂貴，操作技術要求高，限制了它在醫學真菌中的應用。

5 單鏈構象多態性（SSCP）分析

單鏈構象多態性是利用保守區的序列作為引物，以PCR進行擴增，將擴增的DNA片段變性，使其解鏈成為單鏈DNA，在一定條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，DNA上微小的堿基差異即可形成不同的DNA構象，在凝膠上的遷移率亦不同，反映出單鏈DNA片段的多態性。

Kumar等從曲霉病、念珠菌病、角膜炎和皮膚指甲感染病人中分離得到的菌株，用PCR-SSCP對其rRNA的大亞基（LSU）和小亞基（SSU）進行放大和分析，由于使用了小亞基和大亞基特異引物，結果鑒定出各種菌屬。這表明SSCP可以用來區別真菌到屬的水平。

近年來，SSCP法對白念珠菌序列變異進行的檢測結果表明，在DNA多個位點已能夠檢測到SSCPs，并且被序列測定結果證實。由于使用了基因位點特異的引物，故檢測到的等位基因除可用于分類鑒定，還可通過測序了解各多態性的分子基礎。此外，SSCP法還可用于真菌的基因分型等。

6 電泳核型（EK）分析

電泳核型是指細胞中的染色體在一定電場作用下，在固體包埋物中的排列情況，反映了染色體大小、數目和形狀的差異。由于各分類水平上不同分類單位的染色體總會存在一定的差異，因此其EK必然呈現多態性。

EK分析的多態性明顯，分辨率較高，電泳條件穩定時結果的重復性好。但有多種因素可影響實驗結果，如電泳緩沖液的離子濃度、電泳溫度、凝膠硬度、脈沖時間、電壓等等。因此這一潛力很大的分類學方法尚有待于進一步從技術上進行完善和改進。

7 基因探針技術

基因探針技術結合了酶切圖譜法和分子雜交法，原理是應用一段帶有標記的特異性核苷酸序列，通過雜交檢測與探針互補的DNA或RNA片段。基因探針技術與其他一些分子生物學技術（如PCR技術）結合，可以具有很高的敏感性。

黃媛等建立了PCR結合生物素標記的寡核苷酸探針斑點雜交技術鑒定臨床常見真菌的方法，將9種臨床常見致病真菌鑒定到種。Posteraro使用反向斑點雜交方法快速檢測經PCR擴增的真菌DNA，其中念珠菌的種屬特異性探針指向ERG11區域，這項技術比PCR-RFLP有較大提高，可對痕量核酸樣品進行分析，同時基因探針的特異性使實驗結果很少受到非特異性因素的影響，更適用于臨床微生物檢驗。

8 基因芯片技術

DNA 芯片技術是用免疫熒光標記的待測樣品與有規律地固定芯片片基上的大量探針按堿基配對原則進行雜交，通過激光共聚焦熒光系統對芯片進行掃描，用計算機進行熒光信號強度的比較和檢測的技術。其突出特點在于高度并行性、多樣性、微型化和自動化。將不同屬種真菌的特異性DNA標記后制成DNA芯片，將致病真菌DNA與DNA芯片雜交就可得到屬種特異性圖譜，通過這種圖譜的比較和分析，就可得出致病菌的DNA信息，進而可對其進行鑒定。

黃愛華以5.8srDNA與28srDNA間的內轉錄間隔區2為靶標，針對待檢的臨床常見致病真菌念珠菌屬、曲霉屬、皮膚癬菌等設計合成一系列寡核苷酸探針，制成寡核苷酸芯片。待檢真菌DNA經通用引物擴增標記后，與芯片雜交，對雜交圖譜分析歸納，得到一套種特異性的典型雜交圖譜。結果表明，該研究建立的基因芯片技術可以有效地區分20種臨床常見致病真菌，收集從臨床分離的84株致病真菌菌株對基因芯片進行試用，結果顯示基因芯片的鑒定結果與常規鑒定方法的鑒定結果不一致。結論為這項技術的建立可以穩定、特異性地實現臨床常見致病真菌的高通量鑒定，為進一步檢測研究奠定了基礎。