豬人工授精實驗室操作規程

李 強

（四川省畜禽繁育改良總站，四川 成都 610041）

1 豬人工授精實驗室的環境要求

實驗室要求整潔、衛生，每周要徹底清潔一次。

實驗室要求與采精室相鄰，實驗室應分成干燥區和潮濕區，干燥區用于稀釋液的配制和精液的檢查、稀釋、分裝，潮濕區安放水槽，用于清洗器械等。實驗室內最好安裝紫外線燈，每周至少對實驗室徹底消毒一次，下班時開啟，通宵照射。

2 豬人工授精實驗室設備要求

2.1 顯微鏡 其放大倍數可為100、400和 1000倍（油鏡），最好自帶光源、配備恒溫加熱板。

2.2 精子密度測定儀或血細胞計數器 能比較準確地分析出原精密度，確定稀釋倍數。

2.3 電子臺稱 用于稱量精液質量。

2.4 電子天平 稱量藥品配溶液用（精度達到0.01g）。

2.5 數顯恒溫水浴鍋 加熱精液稀釋液以及用于控制精液稀釋液的溫度。

2.6 17℃數顯恒溫精液保存箱波動范圍在±1℃，用于精液的存放。

2.7 數顯恒溫干燥箱和高溫滅菌鍋 用于實驗器皿的預熱和消毒。

2.8 雙重蒸餾水器 用于制備雙蒸水，稀釋液用水最好為3d內制的新鮮蒸餾水。

2.9 量筒、燒杯 1000 mL、2000 mL各兩個，用于準備稀釋液、稀釋精液以及將精液分裝到輸精瓶。

2.10 保溫瓶 各種不同的容器可用于采精，但重要的是要能保溫隔熱、能被消毒。

2.11 pH試紙或pH計 測量精液的pH值。

2.12 玻璃棒 稀釋精液攪拌用。

2.13 溫度計2支 分別用于測量精液和稀釋液的溫度。

2.14 其他 稀釋液配置和精液檢查必備的試劑及藥品、100～500 μL微量移液器及其配套吸頭、采精杯、消毒外科用紗布、輸精瓶（裝 100 mL）、浴巾（保溫用）、市售成品稀釋粉或一些配制精液稀釋液所用的藥品。

3 實驗室的準備工作

3.1 器械的清洗和消毒 （最好采精前一天進行）

3.1.1 洗滌 將采精杯，燒杯，量筒等玻璃器皿用洗衣粉或洗潔精清洗干凈，再用蒸餾水沖洗2次。

3.1.2 消毒 用錫紙包扎玻璃器皿的開口和金屬器械，放恒溫干燥箱中180℃干燥1h，也可和非耐熱器皿一起，用牛皮紙包好放高壓滅菌器中121℃，20 min濕熱滅菌；溫度計采用酒精棉球消毒；消毒過的器械使用前用稀釋液沖洗一遍。

3.2 采精前準備工作

3.2.1 采精前2h，工作人員穿上實驗服，擦凈所有工作臺，保持室內清潔。

3.2.2 用消毒外科紗布套好集精杯，將集精杯、載玻片、蓋玻片及稀釋用的玻棒、溫度計、燒杯等放入37℃恒溫干燥箱中預熱。

3.2.3 采精前1h，配制好稀釋液。

如用市場上出售的成品精液稀釋粉，則應在采精前的1h將稀釋精液和雙蒸餾水按說明比例混勻。

3.2.4 打開水浴鍋，將溫度調至37℃，將配置好的稀釋液放入其中預熱。

3.2.5 準備好顯微鏡，并將恒溫載物臺設定到37℃，將載玻片放在上面預熱。

3.2.6 準備好電子臺秤、精液密度儀或血細胞計數器、微量移液器及其配套吸頭、簽字筆、記號筆、記錄本、蓋玻片等，稱量盛放精液的燒杯的質量并記錄。

3.2.7 將預熱好的采精杯放入保溫瓶中，到采精室采精。

4 精液的品質檢查

4.1 將采集的精液 （用采精杯采集） 從保溫瓶中取出，將用橡皮筋套住的過濾用紗布拿開，而后將精液輕輕地導人預熱好的燒杯中。

4.2 精液量（體積）測定 以電子臺秤稱量精液，按每克1 mL計，精液量（g）=（精子的質量+盛放精液的燒杯的質量）一盛放精液的杯子的質量。避免以量筒等轉移精液盛放容器的方法測量精液的體積。

4.3 顏色 正常的精液是乳白色，呈云霧狀。精子密度越高。顏色越白，其透明度愈低。如呈灰白色或淺灰色，則表示精液密度低，且質量不好。如帶有綠色或黃色是混有膿液或尿液，若帶有淡紅色或紅褐色是含有血液，表明精液中有炎癥物，這樣的精液應舍棄不用。

4.4 氣味 一般正常精液無味或略帶有腥味。如果精液帶有惡臭味，應廢棄不用。

4.5 pH值 （酸堿度） 以pH計或pH試紙測量。正常精液的pH值為6.8～7.8，呈中性或弱堿性。

4.6 精子活力檢查 檢查時，用微量移液器取精液一滴于顯微鏡載物臺恒溫加熱板上已預熱好的載玻片上，蓋上蓋玻片,由下至上調節顯微鏡物鏡，直至出現看到清晰精液。然后計算直線運動的精子占總精子的比例。

4.7 精子密度檢查 指每毫升所含的精子數的多少，是確定精液稀釋倍數、評定精液品質的重要指標。要求用血細胞計數板或精液密度儀進行測定。血細胞計數板計數方法：以微量加樣器取具有代表性原精液100 μL，3%NaCl900 μL，混勻，稀釋 10 倍；血細胞記數室上放一蓋玻片，取1滴上述精液放入計數板槽中，靠虹吸將精液吸入計數室內；在高倍鏡下計數5個中方格內的精子總數，將該數乘以50萬，即得原精液每毫升的精子數（即精液密度）。精液密度儀使用參照其使用說明書。

精子密度也可采用估測法在顯微鏡下觀察，將精子分布情況分為密、中、稀三種。密：精子密集，精子間距離小于一個精子距離（每1mL 3億以上）；中：精子間能容納1～2個精子；稀：精子間距離很大，精子間能容納2個以上精子（每1mL約1億）。

4.8 精子畸形率檢查 畸形率即畸形精子占精子總數的百分率，一般要求畸形率不超過15%，要求每頭公豬每兩周檢查一次畸形率。畸形精子種類很多，包括巨型精子、短小精子、雙頭或雙尾精子、頂體膨脹或脫落、精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部彎曲等。

4.9 認真填寫精液品質檢查登記表。

5 精液的稀釋

5.1 精液采集后應盡快稀釋，原精液放置不能超過30min。

5.2 稀釋倍數的確定：活力≥0.7的精液，一般按每個輸精劑量含40億個有效精子，輸精量為80mL確定稀釋倍數。

5.3 品質檢查不合格（活力0.7以下）的精液不能稀釋。稀釋時稀釋液要求與精液等溫，兩者溫度相差不能超過1℃，即稀釋液應加熱至33～37℃，以精液溫度為標準，來調節稀釋液的溫度，不能反過來操作。

5.4 稀釋時，將稀釋液沿溫度計，玻璃棒或盛精液的杯(瓶)壁緩慢加入到精液中，然后輕輕搖動或用消毒玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌，使其混合均勻。

5.5 高倍稀釋時，應先進行低倍稀釋（1∶1～2），稍待片刻后再將余下的稀釋液沿壁緩慢加入。

5.6 稀釋后要求靜置片刻再作精子活力檢查。如果稀釋前后精子活力一樣，即可進行分裝與保存；如果活力下降，說明稀釋液的配置或稀釋操作有問題，不宜使用，應查明原因并重新配置。

6 精液的常溫保存

6.1 精液稀釋后檢查精液活力，若無明顯下降，立刻按每頭份80mL分裝入瓶，盡量減少精液暴露于環境中的污染時間。

6.2 加蓋密封，在標簽上寫清楚公豬的品種、耳號、采精日期（月、日、時），精液量、稀釋倍數、儲存溫度，良種補貼專用等。

6.3 放置22～25℃的室溫下1h后或用多層毛巾被包好后放置17℃冰箱中，讓其溫度緩慢下降，以免因溫度下降過快造成死精子數增多。

6.4 保存過程中要求每12h將精液混勻1次，每次搖動時，動作要輕緩均勻，同時觀察精液的色澤狀態，做好記錄，發現異常及時處理。

6.5 每天檢查精液保溫箱的溫度，若出現停電應全面檢查貯存精液質量。

注意：要盡量減少精液保存箱關開次數，以免造成對精子的打擊而導致精子死亡；

6.6 每次使用前應對保存的精液進行活力檢查，活力低于0.6的精液應棄之不用。

6.7 稀釋后精液一般要求在3d內用完，否則會影響使用效果。