TGF-β受體Ⅰ型、Ⅱ型在實(shí)驗(yàn)性鼠牙髓炎中的免疫組化研究

韓 杰,楊青嶺,樸松鶴

(1.佳木斯大學(xué)校醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002)

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是一族具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,對(duì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用,有利于胚胎發(fā)育和細(xì)胞修復(fù),參與牙胚的發(fā)生、發(fā)展、成熟以及牙體組織的修復(fù)過程[1]。在哺乳動(dòng)物,已發(fā)現(xiàn)7種 I型受體和5種Ⅱ型受體[2]。轉(zhuǎn)化生長因子受體 (TGF-β R)包括 TGF-β RⅠ、Ⅱ、Ⅲ型3種形式。TGF-β RⅠ、Ⅱ參與了牙胚的發(fā)育及成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞的分化。TGF-β RⅠ、Ⅱ在鼠、牛以及人第三磨牙牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)均有報(bào)道[3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠可復(fù)性牙髓炎模型中不同時(shí)間 TGF-β RⅠ、Ⅱ的動(dòng)態(tài)表達(dá)及定位情況;并探討其在牙髓損傷修復(fù)過程中的生物學(xué)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

昆明產(chǎn) Wistar大鼠 ,雄性 ,24只 ,體重 250～ 300g,購自佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。TGF-β RⅠ、Ⅱ抗體,免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 方法

根據(jù)不同的處死時(shí)間將24只大鼠隨機(jī)分為6組。每組4只,即 0d組(正常組 )、1d組、3d組、5d組、7d組、2周組。10%水合氯醛(3mL/kg)腹部注射麻醉后仰臥固定,用備好的高速渦淪鉆分別在大鼠左右上頜第一磨牙合面進(jìn)行機(jī)械性不噴水鉆磨,均勻磨除釉質(zhì)厚度0.5mm,然后用酸蝕劑處理暴露的牙本質(zhì)表面5min,正常組不做處理。各組鼠分別于0d、 1d、3d、5d、7d、 2w脫頸處死 ,迅速截取左右上頜第一、二、三磨牙連同部分頜骨標(biāo)本,立即將組織塊放入10%甲醛溶液4℃固定48h,經(jīng)20%EDTA脫鈣10 w后,流水沖洗24h,系列乙醇脫水、二甲苯置換,石蠟包埋,各標(biāo)本作4 μm厚的石蠟切片 3張,1張用于 HE染色 ,2張用于免疫組化染色。免疫組化染色使用武漢博士德公司試劑盒,按其說明書操作。石蠟組織標(biāo)本4 μm切片經(jīng)脫蠟至水,30 μL過氧化氫液室溫孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。100μL正常山羊血清室溫孵育 10min,傾去血清。滴加 1滴 (50 μL)1∶200稀釋的TGF-β 1抗體,4℃過夜,加生物素化第二抗體,室溫孵育10min。以上各步之后均用0.01mol/L PBS洗5min3次。 DAB鏡下控制顯色。陽性對(duì)照為乳腺癌組織,陰性對(duì)照用 PBS代替一抗。蘇木素復(fù)染,中性樹膠透明封片 ,觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

1d組鏡下可見血管擴(kuò)張充血,水腫,壓迫成牙本質(zhì)細(xì)胞成扁平狀,少量炎細(xì)胞浸潤。3d組鏡下可見血管擴(kuò)張充血明顯,大量炎細(xì)胞浸潤,成牙本質(zhì)細(xì)胞可見空泡性變。5d組鏡下可見血管擴(kuò)張充血,水腫,牙本質(zhì)層下方可見少量修復(fù)性牙本質(zhì)形成,少量炎細(xì)胞。7d組鏡下可見血管充血,水腫,牙本質(zhì)層下方可見大量修復(fù)性牙本質(zhì)形成,少量炎細(xì)胞。2w組牙本質(zhì)層下方可見大量修復(fù)性牙本質(zhì)形成。

2.2 免疫組化結(jié)果

TGF-β RⅠ、Ⅱ的染色結(jié)果相似 ,0d組牙本質(zhì)細(xì)胞呈陽性表達(dá),牙髓細(xì)胞呈弱陽性表達(dá);1 d組成牙本質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá),牙髓細(xì)胞為弱陽性表達(dá),3d組成牙本質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá),牙髓成細(xì)胞為陽性表達(dá),5d組成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓維細(xì)胞陽性表達(dá),血管壁及內(nèi)皮細(xì)胞可見陽性表達(dá),7d組成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓維細(xì)胞呈陽性表達(dá),至2w組成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓成細(xì)胞呈陽性,修復(fù)牙本質(zhì)可見弱陽性表達(dá)。

2.2.1 TGF- β RⅠ 的表達(dá)

2.2.2 TGF- β RⅡ 的表達(dá)

3 討論

3.1 TGF-β R與反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成

本實(shí)驗(yàn)表明,3d組、5d組表現(xiàn)為牙髓炎急性期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細(xì)胞均強(qiáng)陽性表達(dá)。這與 Sloan[5]的報(bào)道結(jié)果一致。TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá),說明成牙本質(zhì)細(xì)胞對(duì) TGF-β的反應(yīng)性很強(qiáng),TGF-β在牙髓炎急性期期積極參與炎癥因子遞呈,協(xié)調(diào)免疫炎癥反應(yīng)平衡,保護(hù)損傷牙髓組織,刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞合成和分泌牙本質(zhì)基質(zhì)成份,形成反應(yīng)性牙本質(zhì)。研究表明,在牙髓組織炎癥損傷和修復(fù)中,TGF-β抑制細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物對(duì)牙髓組織造成的損傷,如激活巨噬細(xì)胞,趨化單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,刺激其 LI- lβ、 TN F- α、 LI-6、 bFGF等多肽因子的表達(dá) ,以清除和殺滅細(xì)菌及其毒素,抑制和滅活 H2O2、NO等,降低自然殺傷細(xì)胞的生成 ,限制免疫反應(yīng)過度增強(qiáng)[5]。7 d、2w組表現(xiàn)牙髓炎癥恢復(fù)期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本質(zhì)細(xì)胞中均陽性表達(dá),顯示 TGF-β可能參與牙髓修復(fù)過程。Tziafas等[6]研究了外源性 TGF-β 1對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)的誘導(dǎo)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)先用 TGF-β 1中和抗體浸泡的脫鈣牙本質(zhì)完全失去誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的活性,含 TGF-β1的 Milipore膜周圍有一厚層管狀基質(zhì)形成,并有大量伸長極化的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞包繞。Hu等[7]學(xué)者用 TGF-β1進(jìn)行蓋髓實(shí)驗(yàn)也證實(shí),TGF-β1能夠誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。這些研究都說明,TGF-β R在在牙髓損傷修復(fù)和反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成過程中起著重要的作用。

3.2 TGF-β R與修復(fù)性牙本質(zhì)的形成

牙髓作為機(jī)體內(nèi)的一種特殊組織,其損傷修復(fù)機(jī)制也同樣具有獨(dú)特性。牙髓組織在創(chuàng)傷感染時(shí),通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)使未分化間充質(zhì)細(xì)胞、牙髓細(xì)胞增殖、分化,分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成牙本質(zhì)橋而獲得自身修復(fù)的能力。這也是追求牙髓活髓保存治療的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)表明,3d組、5d組表現(xiàn)為牙髓炎急性期,7d組牙髓炎癥恢復(fù)期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在牙髓細(xì)胞均陽性表達(dá) ,比 0d組、1d組表達(dá)增強(qiáng)。表明這些牙髓細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)性增強(qiáng),TGF-β促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖、分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,替代受損成牙本質(zhì)細(xì)胞,分泌修復(fù)性牙本質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)從 TGF-β受體角度研究,觀察 TGF-βⅠ、Ⅱ受體在大鼠牙髓細(xì)胞的表達(dá)與分布情況,研究 TGF-β作為一種有效的生物活性因子,作用于成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞表面的 TGF-βⅠ、Ⅱ受體,一方面促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)形成反應(yīng)性牙本質(zhì);另一方面促進(jìn)牙髓細(xì)胞生長、分化為牙本質(zhì)樣細(xì)胞,代替受損的成牙本質(zhì)細(xì)胞,形成修復(fù)性牙本質(zhì)。TGF-β RⅠ、Ⅱ的表達(dá)水平可能決定著細(xì)胞對(duì)TGF-β因子的反應(yīng),從而可提高牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的自身修復(fù)再生能力,是牙髓組織損傷修復(fù)的重要機(jī)制之一。因此,推測(cè) TGF-βⅠ、Ⅱ受體在牙髓組織損傷修復(fù)過程中具有重要作用。

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