A β25～35寡聚體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸的損傷作用

胡旭慧,黃昕艷,朱曉峰

(佳木斯大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所,黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性認知功能減退為特征的神經(jīng)變性疾病。典型的病理學(xué)改變?yōu)?老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元突觸功能異常。AD的病因復(fù)雜,AD是多種因素共同參與的結(jié)果,其中老年斑的主要成分β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β,A β)被認為是該病發(fā)病機制中的起始因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié),尤其是可溶性 A β寡聚體的神經(jīng)毒性作用日益被重視,突觸功能障礙及缺失是與認知功能下降關(guān)系最為密切的病理變化。突觸可塑性被認為是學(xué)習(xí)和記憶的生理基礎(chǔ),與生長相關(guān)蛋白43(growth-associated protein43,GAP-43)的表達相關(guān),國際上將 GAP-43列為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性的首選分子探針。本研究用 A β25～35寡聚體作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元 ,觀察寡聚體 A β25～35對 GAP-43表達的影響 ,以期對 AD早期的發(fā)病機制有進一步的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

B27添加劑、DM EM/F12、胎牛血清購自 GIBCO,GAP-43及 A β25～35均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

選用出生1d內(nèi)的 Wistar大鼠,解剖分離出海馬,經(jīng)0.125%胰酶消化8～12min,用含有10%胎牛血清的DM EM/F12種植液終止消化。經(jīng)懸浮、離心、過濾等步驟收集細胞,用種植液制成密度為 5× 105個 /mL的單細胞懸液 ,接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換含 2%B27的 DMEM/F12培養(yǎng)基。每隔3d半量換液1次。

1.2.2 實驗分組及 A β25～35寡聚體干預(yù)

海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7d后,棄原培養(yǎng)液。加入 DMEM培養(yǎng)液及 A β25～35寡聚體 ,A β25～35寡聚體的制備參考王建秀等文獻[1,2]。實驗分為三組 ,使 A β25～35寡聚體的終濃度分別為 0.2、1、5umol/L,同時設(shè)不加 A β25～35寡聚體的對照組。每組設(shè) 8孔。1h后終止培養(yǎng),以 GAP-43為一抗,進行免疫細胞化學(xué)染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

A β不同濃度組對 GAP-43表達的影響,見表1。

表1 A β25～35寡聚體不同濃度組對 GAP-43表達的影響 (± s,n=8)

表1 A β25～35寡聚體不同濃度組對 GAP-43表達的影響 (± s,n=8)

與正常對照組比較# P＞ 0.05,△P＜ 0.05,*P＜ 0.01,1umol/L組與5umol/L組比較,P ＜0.01。

組 別 平均灰度值正 常 對 照 組 238.65±0.26 0.2umol/L組 238.73± 0.24#1umol/L組 239.06± 0.22△5umol/L組 251.71± 0.26*

3 討論

以往對 A β神經(jīng)毒性研究集中于聚集態(tài),近來研究表明,A β在形成纖維性沉積前的中間體狀態(tài)即 A β寡聚體亦可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。AD早期,非纖維狀、寡聚的 A β可在極低濃度即迅速引起突觸功能紊亂[3],其神經(jīng)毒性遠強于其他不可溶性類淀粉樣蛋白,而突觸功能障礙及缺失是與認知功能下降關(guān)系最為密切的病理變化[4]。腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性已被證實是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)生物學(xué)機制,而可溶性A β寡聚體能夠直接參與 AD中突觸可塑性和記憶的損傷[5],故研究 A β寡聚體致傷與突觸蛋白的改變對于闡明 AD的發(fā)病機制很有益處。GAP-43是神經(jīng)組織特有的一種磷酸蛋白,具有高親水性并可能通過與膜脂肪酸共價連接而與神經(jīng)元膜結(jié)合,分布于突觸前膜和生長錐上,特別是在生長、分化及再生的軸突末端含量最高。突觸可塑性變化與 GAP-43的表達相關(guān),首先突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化可導(dǎo)致 GAP-43表達的變化。其次,由長時程增強和長時程抑制所引發(fā)的突觸效能的變化,可影響 GAP-43的磷酸化狀態(tài)和 mRNA的表達。有研究發(fā)現(xiàn) GAP-43磷酸化程度與長時程增強的表達呈正相關(guān)。因此,GAP-43可作為研究與認知相關(guān)的腦區(qū)發(fā)生突觸可塑性改變的重要標志。本研究結(jié)果表明 ,A β25～35寡聚體能低 GAP-43的表達,呈劑量依賴性,5umol/L A β的致傷作用非常顯著。可以推測,在此濃度作用下軸突生長基本停止,遞質(zhì)釋放受到抑制,突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合出現(xiàn)障礙,突觸可塑性嚴重受損。隨著對 A β寡聚體、突觸可塑性機制的深入的研究與了解,可進一步揭示 AD的發(fā)病機制,將會促進靶向 A β寡聚體的藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用,可能會在神經(jīng)變性之前阻斷 A β寡聚體對突觸的損害,重新建立神經(jīng)突觸,為AD的早期干預(yù)、治療以及新藥物的研發(fā)開拓了新的思路與方向。

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