細菌生物膜與導管伴生感染相關性的研究

劉新,王嵐,劉穎,張曉科

(1.沈陽醫學院基礎醫學院病原生物學研究室,遼寧省環境污染與微生態學重點實驗室,遼寧 沈陽 110034;2.解放軍沈陽 202醫院干診科;3.中國醫科大學附屬第一醫院重癥監護病房)

現代醫學技術的發展,多種侵入性的醫療器械、生物醫學材料廣泛應用,如傳統的導尿管、子宮節育環、中心靜脈導管、新型的人工心臟瓣膜、各種支架、角膜接觸鏡等,這些器械和材料的應用,在解決了原有醫療問題的同時,許多引發了伴生感染 (associated infection)[1],此種現象在有置入性導管者表現尤為突出有研究發現,細菌容易粘附于塑料輸液管內表面,形成細菌生物膜 (biofilm),難以沖洗清除[2]。為了解細菌生物膜與置入性導管伴生感染相關性,我們對醫院實施置入性導管進行檢查或治療的患者撤出導管時進行細菌檢查、分離培養及生物膜形成的研究,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年7月至 2010年6月,采集來自沈陽市多家醫院病房患者包括導尿管、呼吸機導管及手術的引流管等標本,共 62例 (臨檢已判定有感染,病原菌主要包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌),無菌操作下,將近人體端 1cm導管外壁 70%酒精涂抹消毒后,縱向剪開,接種環滅菌刮取內壁后接種于 LB肉湯培養基中增菌,37℃過夜,然后用其肉湯分別接種于血平板、麥康凱培養基上,可疑鮑曼不動桿菌轉種于青霉素?諾氟沙星培養基上培養。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 初步鑒定 過夜培養的肉湯直接涂片,革蘭染色;平板上可疑菌落觸酶試驗、氧化酶、甘露醇試驗、硝酸鹽還原動力試驗及明膠酶試驗。然后轉種相應培養基,純化。

1.2.2 菌種鑒定及生物膜模式株篩選 經初步鑒定的菌種,采用生物—梅里埃公司 ATB生化鑒定分析儀,按 ID 32 GN革蘭陰性桿菌鑒定試條(Ref.32 100)、ID 32 STAPH葡萄球菌鑒定試條(Ref.32 500)及 ID 32 C酵母菌鑒定試條 (Ref.32 200)說明書進行鑒定到種。將臨床標本中分離純化的菌株在剛果紅培養基培養[3],產生生物膜的菌株菌落呈深紅色,非模式株菌落為無色。

1.3 生物膜形態觀察

1.3.1 細菌生物膜染色快速鑒定 根據文獻[4]配制生物膜染液:阿利新藍 -剛果紅染液:阿利新藍染液:阿利新藍 2g,冰醋酸 3ml,蒸餾水 97m l;剛果紅染液:剛果紅 2g,蒸餾水 100ml。染色方法:接種環直接刮取導管內壁粘液涂于潔凈載玻片上,滴加 10μl阿利新藍染液,混勻,靜置 3～5min,火焰加熱固定,直至染液揮發完全,滴加 20μl剛果紅染液,均勻涂布,火焰加熱干燥后,三蒸水沖洗,吸干水分后油浸鏡 (NIKON-80I)下觀察。

1.3.2 細菌生物膜形態結構觀察 將導管標本分別浸泡于 LB肉湯中,封口膜封口防止污染,Innova40溫控搖床 37℃連續震蕩培養,振幅為 50Hz,每隔 48h取出 PBS沖洗,除去浮游菌,換新培養液,鮑曼不動桿菌持續 7d,其他菌持續 5d。振蕩培養后的引流管經 2.5%戊二醛 4℃下固定 24h,pH7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗 3次,再以 1%的鋨酸4℃固定 2h,4℃雙蒸水沖洗 3次,梯度乙醇脫水(以 50%、70%、80%、90%、95%兩次、100%三次,每次脫水時間 10min),醋酸異戊酯置換,CO2臨界點干燥,離子噴金鍍膜,通過 KYKY-3200 SEM掃描觀察引流管內壁生物膜形態結構。

1.4 生物膜定量 將剛果紅培養基上菌落為深紅色的菌種,初步確定形成生物膜的模式株,參照文獻[5,6]用微量板進行生物膜定量檢測,96孔板于37℃分別培養 3d后取出,輕輕拍出孔內液體,然后用 PBS緩沖液沖洗四次,去除浮游菌。用 1%結晶紫染色 15min,三蒸水再次沖洗,待孔板晾干后,向每孔內加入無水乙醇 -丙酮 (80∶20 v/v)200μl脫色,置于酶標儀 (BioTek ELx800,美國)上測定吸光度 (OD 570 nm)值。

2 結果

2.1 菌種鑒定 62例導管標本,分離出細菌 137株,其中鮑曼不動桿菌 43例 (31.39%),銅綠假單胞菌 41例 (29.93%),大腸埃希菌 22例(16.05%),葡萄球菌屬 14例 (10.22%),肺炎克雷伯菌 10例,真菌 4例 (4/137,2.92%),其它 7例 (5.11%),有 11例標本有多種細菌混合感染。ATB生化鑒定菌株:鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌的純度達 99.9%。

2.2 生物膜定性 62例臨床標本中有 38例在剛果紅培養基不同程度菌落呈深紅色,為產生生物膜的菌株,陽性率為 61.29%。另 24例菌在剛果紅培養基培養,菌落始終為無色。采用阿利新藍-剛果紅涂片染色,生物膜型細菌因胞外多糖被染成深紅色,未成膜的細菌為黃色,背景為藍色。

2.3 細菌生物膜的定量檢測 圖 1表明微量板上生物膜形成,我們發現顏色最深的孔,恰恰是剛果紅培養基上呈深色菌落的模式株。枯草桿菌不形成生物膜為陰性對照,幾乎無色。

圖1 微量板上生物膜形成(紫色孔是生物膜形成菌株,顏色越深表明形成的膜越多)

將微量板經過酶標儀測定結果見表1。

表1 細菌生物膜的定量檢測

2.4 掃描電鏡觀察結果 導管內表面有膜狀物質形成,膜內可見細菌聚集于交聯的纖維素樣物質中 (圖 2 A),由于枯草桿菌無胞外多糖,不能形成生物膜,為陰性對照 (圖 2 B),培養 5d的膜厚度可達 4.92μm(圖 2C)。

圖2 導管內細菌生物膜形態結構(A導管內形成的生物膜,B無生物膜形成的對照組,C培養 5d的膜厚度)

3 討論

本研究發現有感染的患者導管內均有細菌檢出,11例患者有多種菌混合感染,病原菌以革蘭陰性桿菌為主 (116/137,84.67%),其中銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌是主要致病菌,這些菌均是臨床耐藥嚴重的菌株。

銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌屬于機會致病菌 ,可引起呼吸道、泌尿生殖道感染及敗血癥等嚴重感染,其中以呼吸道感染最為常見,本研究 62例導管標本中呼吸道感染者 44例 (70.96%),如此高感染率,急需快速檢測方法進行診斷,我們在研究中采用結晶紫染色方法對細菌生物膜進行定量檢測,阿利新藍染色進行生物膜定位,這些實驗技術簡便快速,可選為臨床快速診斷適宜的方法。掃描電鏡可直接觀察生物膜的形態特征及結構,但其實驗環節多,技術復雜并要求特殊設備,更適用于研究。

患者有侵入性導管操作時,盡管醫護人員非常注意無菌技術,但這些患者的醫院感染率仍然高于其他患者,以往的報告常限于菌群種類和耐藥性分析,而關于這些病原菌如何引起感染少有報道,特別是 ICU患者病情重,各種侵入型導管多,這些導管因與外界相通,為細菌粘附提供了機會。本研究發現具有較強粘附性的機會致病菌一旦定植于導管,在導管內的氣體或液體的流動沖刷下,容易形成生物膜 (38/62,61.29%)。將導管浸入于肉湯培養液中,搖床連續振蕩,模擬導管液體流動狀態,3天即可形成不易剝離的生物膜,提示這些細菌在醫用導管內定植快,易于形成生物膜,尤其是來源于應用呼吸機通氣的通氣管,鮑曼不動桿菌形成生物膜比率更高,導致 ICU患者呼吸道感染鮑曼不動桿菌呈逐年增多趨勢。鮑曼不動桿菌在自然環境中普遍存在,具有較強粘附性,屬于條件致病菌,置入性導管高感染率的重要原因可能與細菌導管中快速粘附、定植形成生物膜有關[7],這應引起我們足夠的重視。

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