理解原理 尋求創(chuàng)新

生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，觀察和實(shí)驗(yàn)是生物科學(xué)基本的研究方法。光合作用是高中生物學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容之一。葉綠體是光合作用的場所，做好必修一《分子與細(xì)胞》中“綠葉中色素的提取和分離”的實(shí)驗(yàn)，有助于學(xué)生理解葉綠體中色素的種類和含量，加深學(xué)生對色素作用的理解，進(jìn)而對光合作用的理解和掌握。

1 理解實(shí)驗(yàn)原理

課程標(biāo)準(zhǔn)要求，學(xué)生必須知道每個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)程序和每步操作的目的和理論依據(jù)。教材為此設(shè)計(jì)了一個(gè)比較詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，學(xué)生能不能出色地完成此實(shí)驗(yàn)，關(guān)鍵在于對實(shí)驗(yàn)原理能否很好地理解。實(shí)驗(yàn)的每個(gè)步驟均有其內(nèi)在的道理，因此說，理解原理不僅是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，也是理解實(shí)驗(yàn)方法步驟的關(guān)鍵。若能將實(shí)驗(yàn)原理知識(shí)遷移到實(shí)驗(yàn)方法步驟中去，學(xué)生就更易理解。如：

①取材時(shí)要選取新鮮的、顏色深綠的葉片。目的是使濾液中含有較多的色素。

②由于光合色素位于葉綠體的囊狀結(jié)構(gòu)上。要把它提取出來必須破壞葉表皮、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、葉綠體的雙層膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，目的是為了研磨得更加充分，更有效地破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。加入少許碳酸鈣的目的是為了防止在研磨過程中，葉綠素受到破壞。因?yàn)槿~綠素分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)鎂原子，當(dāng)細(xì)胞破裂時(shí)，細(xì)胞液內(nèi)有機(jī)酸中的氫可取代鎂原子而成為褐色的去鎂葉綠素，碳酸鈣可中和有機(jī)酸以防止去鎂反應(yīng)的發(fā)生。又因?yàn)槿~綠體的色素不溶于水，但可溶于有機(jī)溶劑中，所以還要加入無水乙醇使色素溶解，從而提取各種色素。

③研磨要迅速、充分。這是因?yàn)闊o水乙醇易揮發(fā)，同時(shí)葉綠素極不穩(wěn)定，易被活細(xì)胞中的葉綠素酶水解而破壞。

④制備濾紙條時(shí)，根據(jù)小孔(邊緣)擴(kuò)散原理，物貢分子沿邊緣擴(kuò)散速度要大于里邊擴(kuò)散的速度，因此要將濾紙條的一端剪去兩角(剪角后底邊寬度接近濾紙條寬度的1/2時(shí)為最好)，這樣，可有效防止濾紙條兩側(cè)色素?cái)U(kuò)散過快的現(xiàn)象，而使色素帶平行、整齊，則由于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在距去兩角的一端1 cm處用鉛筆畫一條細(xì)的橫線，目的是為畫濾液細(xì)線提供參照線。畫濾液細(xì)線時(shí)，待濾液干燥后重復(fù)畫1～2次，是為了增加色素的分子數(shù)，以便在濾紙條上分離出4條明顯的色素帶來。如果在不干燥的情況下連續(xù)畫線，色素會(huì)隨濾液中的液體在濾紙條上的擴(kuò)散而擴(kuò)散，畫出的濾液細(xì)線較寬，其分離結(jié)果是相鄰的兩條色素帶會(huì)發(fā)生部分重疊。

⑤分離的原理與4種色素在層析液中的溶解度有關(guān)。層析液是一種脂溶性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑，由于4種色素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同，因此每一種色素分子在層析液中的溶解度不同，因而4種色素隨層析液在濾紙條上的擴(kuò)散速度就不同，其中胡蘿卜素在層析液中的溶解度最高，擴(kuò)散速度最快，其次是葉黃素、葉綠素a，葉綠素b溶解度最低，擴(kuò)散得最慢。依據(jù)此原理使濾紙條上處于同一濾液細(xì)線上的4種色素在擴(kuò)散中分離開來。

⑥將3 mL層析液倒入試管中，將濾紙條(有濾液細(xì)線的一端朝下)輕輕插入層析液中，濾紙條斜靠著試管內(nèi)壁，隨后用棉塞塞緊試管口。注意不能讓濾紙條與沾有層析液的試管內(nèi)壁緊貼，也不能讓濾液細(xì)線觸及層析液，因?yàn)樯貢?huì)溶解于層析液中，導(dǎo)致分離的色素帶不清晰，影響實(shí)驗(yàn)效果。

因此，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，教師要講清或提出問題讓學(xué)生思考，使學(xué)生不但知其然，還要知其所以然。在指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)時(shí)，要求學(xué)生嚴(yán)格按教材要求操作，然而學(xué)生們的實(shí)驗(yàn)成功率總是不高，于是筆者同學(xué)生一起分析原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)教材在實(shí)驗(yàn)取材、提取色素的方法、畫濾液細(xì)線、分離色素等方面均有不足。為此，做了一些改進(jìn)再實(shí)驗(yàn)，取得了顯著的效果。

2 尋求創(chuàng)新方法

2.1 提取綠葉中色素的改進(jìn)

獲取高濃度的色素提取液是該實(shí)驗(yàn)成功的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。色素提取液的質(zhì)量高低直接影響到分離效果的好壞乃至整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。如何提取綠葉中的色素，教材中介紹的做法是：稱取5 g新鮮的綠色葉片(如菠菜葉)剪碎，放入研缽中，向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，再加入10 mL無水乙醇，進(jìn)行迅速、充分的研磨，然后將研磨液迅速倒入玻璃漏斗(漏斗基部放一塊單層尼龍布)中進(jìn)行過濾，將濾液收集到試管中，及時(shí)用棉塞將試管口塞嚴(yán)，供隨后進(jìn)行的分離色素步驟用。

經(jīng)過多次的實(shí)踐，師生覺得教材介紹的方法存在的問題有：

①所用材料過多，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組要用5 g菠菜葉。

②所用藥品種數(shù)過多，而且二氧化硅、碳酸鈣的用量又不好把握(二氧化硅是特別細(xì)的白色粉末，易過量，使濾液中含有較多的二氧化硅，而導(dǎo)致濾液顏色變淺；難溶于水的碳酸鈣明顯地殘存于濾液中，濾液中雜質(zhì)多，顏色淺，影響實(shí)驗(yàn)效果)，無水乙醇用量大，一次要用10 mL。

③所用儀器多，操作步驟多，既要研磨，又要過濾，提取濾液所需時(shí)間較長。

④進(jìn)行“迅速、充分的研磨”，研磨到什么程度才叫充分呢?葉片呈細(xì)碎片狀，算研磨充分嗎?可是此時(shí)提取的濾液顏色淡，色素含量不高，且渾濁，經(jīng)紙層析后分離效果欠佳。

針對以上問題，對綠葉中色素的提取進(jìn)行了較大的改進(jìn)：

改“研磨法”使葉肉細(xì)胞破裂、使色素溶解在無水乙醇中為“水浴加熱法”，讓葉片中的色素溶解在無水乙醇里，具體實(shí)施方法如下：

每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組稱取1 g綠色葉片，剪碎放入試管底部，用量筒量取1.5～2 mL無水乙醇倒入試管中，將試管置于沸水中水浴加熱1～2 min，使葉片含有的色素溶解在無水乙醇里，當(dāng)看到試管中的液體呈深綠色時(shí)，即可將試管從沸水中取出，冷卻待用。

改進(jìn)后的方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

①取材廣泛。由于省去了研磨這一步驟，一些較難研磨的常見木本植物(如大葉黃楊、樟樹、竹葉、法國梧桐等)、常見的植物(如美人蕉、車前草等)、菜農(nóng)廢棄的葉片(如佛手瓜、蘿卜、胡蘿卜、甘薯等)也可用做實(shí)驗(yàn)材料(若能在室內(nèi)預(yù)先晾半天，失掉一些水分，效果更好)，只要顏色深綠，效果都很好，使材料來源更加廣泛，可就地取材，減少季節(jié)、氣候等因素對實(shí)驗(yàn)的影響。

②節(jié)約材料。原來需5 g葉片，改進(jìn)后只需1 g，僅是原來的1／5，能節(jié)約材料。同時(shí)用量少更能挑選質(zhì)量好、老嫩適中的葉片做實(shí)驗(yàn)材料，以提高色素提取液的質(zhì)量。

③節(jié)約藥品。原來要用10 mL無水乙醇作溶劑，改進(jìn)后只用1.5-2 mL即可，僅約為原來的1／5。改進(jìn)后完全不用二氧化硅和碳酸鈣，節(jié)約了大量的藥品。這也符合當(dāng)今的時(shí)代要求(建立資源節(jié)約型社會(huì))。

④節(jié)約時(shí)間。原來的操作程序繁瑣，既要研磨，又要過濾，所花時(shí)間較長，一般要10 min左右才能得到濾液，使很多學(xué)生在一節(jié)課的時(shí)間內(nèi)不能完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。改進(jìn)后只要事先準(zhǔn)備沸水，而且可以幾個(gè)實(shí)驗(yàn)小組共用一杯沸水。稱取葉片后稍微剪碎，放進(jìn)試管，加好無水乙醇，將試管放進(jìn)沸水中水浴約2 min，即可得到理想的色素提取液。取出試管，稍微冷卻，然后將試管中的提取液小心倒入另一支試管中，就可畫濾液細(xì)線(也可省去傾倒這一步，用滴管直接在原試管中吸取冷卻的色素提取液)。

⑤實(shí)驗(yàn)效果好。原來提取的濾液，部分學(xué)生常因操作不當(dāng)容易產(chǎn)生失誤，得到的濾液常呈黃綠色，渾濁不清，稍微放置后容易分層，經(jīng)紙層析后，色素分離效果總是欠佳。改進(jìn)后提取的色素液，墨綠透明，濃度高，畫濾液細(xì)線只要畫2-3次，經(jīng)層析分離后，4條色素帶清晰分明。

另外，如果幾個(gè)實(shí)驗(yàn)小組共用一套儀器提取綠葉中的色素，則可相應(yīng)地增加葉片和無水乙醇的用量，用小燒杯盛裝后置于大燒杯中水浴，則可一次制得量較多而又耐用的色素提取液。

2.2 制備濾紙條的改進(jìn)

教材介紹：將干燥的定性濾紙剪成長和寬略小于試管長和寬的濾紙條。由于濾紙條過長、過寬，其重量過大，在層析過程中濾紙條易變軟下塌，使濾液細(xì)線沒入層析液中；另外，多個(gè)班級(jí)多個(gè)實(shí)驗(yàn)小組輪流做實(shí)驗(yàn)時(shí)，難保試管壁干燥，則濾紙條易被試管壁水珠沾濕，影響實(shí)驗(yàn)效果。為了找到妥善的解決辦法，教師號(hào)召學(xué)生大膽探索，經(jīng)過各種對比實(shí)驗(yàn)，學(xué)生們得出了如下方法解決這一難題：懸空在試管中或燒杯內(nèi)，不能讓它碰到壁上，具體操作方法見后面2.4。

本實(shí)驗(yàn)不僅可用條形濾紙進(jìn)行層析，還可以采用圓形濾紙進(jìn)行層析。

2.3 畫濾液細(xì)線的改進(jìn)

畫濾液細(xì)線是要求很高的一個(gè)操作步驟。色素帶分離效果的好壞與濾液細(xì)線畫得是否“細(xì)、直、齊”直接相關(guān)，而教材中介紹的用毛細(xì)吸管吸取少量濾液畫細(xì)線，因條件限制，實(shí)驗(yàn)室無法拉制毛細(xì)吸管，再說此方法也不好操作，學(xué)生采用以下2種嘗試方法：

(1)蓋章法。

用滴管吸取一滴濾液滴在一潔凈載玻片的中央，當(dāng)作“印泥”，用潔凈蓋玻片或塑料膠片的一側(cè)作“印章”，沾取濾液，然后對齊濾紙條上的參照線，垂直按下印到濾紙條上，并稱其為“蓋章”，待濾液干后重復(fù)2～3次，此法省時(shí)省力，且畫的濾液細(xì)線較易達(dá)到“細(xì)、直、齊”。

(2)點(diǎn)樣法。

在濾紙條上畫濾液細(xì)線有一定難度，而點(diǎn)色素斑比畫濾液細(xì)線則容易得多。將一干燥的的圓形定性濾紙(直徑為11 cm)蓋在培養(yǎng)皿上，在中央用細(xì)毛筆點(diǎn)上2。3次色素提取液(點(diǎn)在同一點(diǎn)上)，點(diǎn)成圓形的色素斑。

2.4 分離色素裝置的改進(jìn)

2.4.1 試管法

針對層析時(shí)，濾紙條容易下滑到試管中，改進(jìn)的作法是：取1枚大頭針，將它的一端折成勾狀，另一端插入試管塞，再用1個(gè)回形針掛在勾上，用回形針夾住畫好濾液細(xì)線的濾紙條(濾紙條的長度事先量好，不能讓層析液沒及濾液細(xì)線)，將3 mL層析液倒入試管中，用試管塞塞緊試管口，進(jìn)行層析。

2.4.2 燒杯法

因?yàn)樵嚬芸臻g小，操作難度還是較大，容易使濾紙條邊緣碰到壁上而沾上層析液從而影響其實(shí)驗(yàn)效果。對此可改為用燒杯層析：此法還可幾個(gè)實(shí)驗(yàn)小組共用一份層析液，節(jié)約藥品。事先量好燒杯的高度，再根據(jù)燒杯高度制備濾紙條，讓濾紙條長度長出燒杯1 cm，將長出部分做直角彎折，另一端仍剪去兩角，在距頂端1 cm處畫濾液細(xì)線。然后將培養(yǎng)皿的內(nèi)頂壁涂上膠水，再將濾紙條彎折部分貼于內(nèi)頂壁，可以將數(shù)條濾紙呈輪狀依次貼妥。向燒杯中注入適量的層析液，加蓋培養(yǎng)皿蓋，這時(shí)的濾紙條均垂直懸于培養(yǎng)皿的內(nèi)頂壁，高度一致，互不粘連，吸層析液后仍保持垂直狀態(tài)。

2.4.3 培養(yǎng)皿法

對點(diǎn)樣法的層析：取一枚縫衣針，穿一條細(xì)棉線，在棉線末端打個(gè)結(jié)，將針從圓形濾紙正面穿過色素斑中心，在距線結(jié)約4 cm處剪斷棉線。取直徑10 cm的培養(yǎng)皿一套，向培養(yǎng)皿底中加入5 mL層析液。把上述圓形濾紙扣在培養(yǎng)皿底上面，無線結(jié)的一面朝下，棉線則浸沒在層析液中，再將培養(yǎng)皿蓋蓋在濾紙上。采用此方法，可以看到色素隨層析液由線結(jié)處向周圍均勻擴(kuò)散。幾分鐘后，可觀察到4個(gè)近似同心圓的大小不一的顏色清晰的色素環(huán)，實(shí)驗(yàn)效果非常顯著。而且層析時(shí)，不用擔(dān)心濾紙上的色素會(huì)沒及到層析液中，不失為一種好方法。

2.5 層析液的改進(jìn)

教材中給出了兩種層析液配方：①石油醚：丙酮：苯(20：2：1)；②93號(hào)汽油。通過查閱資料知道也可用如下配方：③石油醚：丙酮(10：1)；④石油醚：酒精(10：1)；⑤純酒精；⑥純石油醚。這些方法的分離效果也都很好，果真如此嗎?

因此教師有意設(shè)計(jì)了一個(gè)比較實(shí)驗(yàn)，通過師生共同探索、討論，試圖找到一種分離色素的最佳層析液。要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組都用3種層析液進(jìn)行層析，其中①、②為必做，另外按組別分別做③、④、⑤、⑥中的一種，比較分離色素的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

(1)層析液①的分離效果好，且速度快；

(2)層析液②的分離效果欠佳，胡蘿卜素、葉黃素顏色非常淺，且葉綠素a、葉綠素b很難分開：

(3)層析液③的分離效果與①差不多：

(4)層析液④分離出的色素帶中葉綠素a與葉黃素位置發(fā)生了互換：

(5)層析液⑤、⑥雖簡便一些，但分離效果欠佳。

別外，如果考慮到苯對人體有害，則配方③是一種較好的層析液。

2.6 實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)很重要的一條原則是對照原則，教師可設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)，加深學(xué)生對本實(shí)驗(yàn)的理解和掌握。

如設(shè)立一個(gè)空白對照組，在其他條件完全相同的情況下，不畫濾液細(xì)線，結(jié)果進(jìn)行對照，消除“不同色帶是層析液在濾紙上擴(kuò)散后留下的顏色”的懷疑。這樣同時(shí)也培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)作風(fēng)，體現(xiàn)生物學(xué)科研的基本原則。

為了強(qiáng)調(diào)不要使層析液沒及濾液細(xì)線的意義。也可以設(shè)立一個(gè)沒及濾液細(xì)線的對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色素會(huì)被溶解下來，而導(dǎo)致無法分離。

教師還可鼓勵(lì)學(xué)生通過對比實(shí)驗(yàn)來研究哪種方法能達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)效果。如綠葉與無水乙醇的量的比例作一研究；對濾紙條的畫線次數(shù)的研究等，通過進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論。

經(jīng)過以上改進(jìn)后，此實(shí)驗(yàn)的成功率大大提高了，學(xué)生也終于悟出：不應(yīng)迷信課本，不能為做實(shí)驗(yàn)而做實(shí)驗(yàn)，而要敢于設(shè)想，大膽探索科學(xué)的操作方法，多動(dòng)腦、多動(dòng)手。其實(shí)實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)本身就不是唯一的，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都沒有固定的不可變更的模式。為了得到明顯的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，達(dá)到滿意的實(shí)驗(yàn)效果，師生要不斷鉆研，勇于探索，努力尋求更便捷、效果更好的實(shí)驗(yàn)方法。要是能經(jīng)常這樣嘗試，非常有利于培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新意識(shí)，能全面提高學(xué)生的科學(xué)素質(zhì)。