OPN和BMP15基因與大長雜交一代母豬產仔數的關系

孫敬禮，武 磊，黃 濤,李大全，劉賢俠

（1.石河子大學動物科技學院，新疆??石河子??832003；2.新疆克拉瑪依瑞恒畜牧開發有限責任公司，新疆??克拉瑪依??834000）

母豬的產仔數是一個重要的經濟性狀，產仔數的高低直接影響到豬場的經濟效益。因此，有效地提高豬的產仔數，特別是提高豬的產活仔數，一直是科學研究和養豬生產的主要任務之一。近年來，隨著分子生物學技術和現代繁育理論的不斷發展，從基因水平對豬高繁殖力機制進行探討已成為一研究主題。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的分泌型糖基化磷蛋白,廣泛存在于乳汁、子宮、胎盤等組織和體液中,具有多種生物學活性。鑒于其在動物繁殖中的重要功能。，近年來，它成為在豬繁殖性狀的重要候選基因之一[1]。骨形成蛋白 15（bone?morphogenetic?protein-15，BMP15）是由卵母細胞分泌的一種生長因子，對早期卵泡的生長、分化和排卵起重要作用；許多研究表明BMP15可能具有促進卵泡發育，防止黃體早熟的生物學功能[2]。目前，許多學者都將其作為控制產仔數的候選基因加以研究。本文主要分析大長雜交一代母豬OPN和BMP15不同基因型以及合并基因型對經產母豬的產仔數差異，為利用DNA標記輔助選擇方法提高母豬綜合繁殖性能提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

產仔2胎以上且記錄完備的大長雜交一代母豬樣本119頭,采自瑞恒公司豬場。前腔靜脈采血，EDTA抗凝。

1.2 DNA提取

采用苯酚-氯仿-異戊醇抽提方法提取DNA，置于-20?℃冰箱中保存備用。

1.3 引物設計

本研究所用引物分別參照Knoll等[3]、候振平等[4]所發表的引物序列由上海生工生物技術公司合成引物。OPN-F：5?-TCACCGATTTCCCCACCGACAC-3?；OPN-R ：5?-TGGCTGCGGGTTTCCACACTG-3?。BMP15-F ：5?-GATGCGTCTGCCACCTACAT?-3?；BMP15-R ：5?-?CCGGAACTCAAGAATCTCAC?-3?。

1.4 PCR擴增

OPN、FSHβ和ESR基因采用相同的反應體系：10×Buffer?2.5，μL，dNTP2μL,上、 下 游 引 物 各0.5?μL（10μmol/L），50?ng/μL 模 板 DNA?1μL，Taq 酶?1U，Mgcl2?2?μL，加雙蒸水至 25?μL。

OPN基因的PCR擴增反應條件：94?℃變性4?min，35 次循環（94?℃，40?s；60?℃，1?min；72?℃，1.1?min）,72?℃延伸 10?min。

BMP15基因的PCR擴增反應條件:94℃變性4?min,?35 次 循 環（94?℃，30?s；58?℃，30?s；72?℃，30s）,72?℃延伸 10?min。

1.5 多態性檢測

OPN基因由片段插入造成，瓊脂糖電泳檢測PCR產物即可見多態性，PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠上顯示為 3種帶型 ：1295?bp、1295/990?bp和 990?bp， 分 別 為 AA、AB和 BB型。BMP15基 因采 用?PCR-RFLP 進 行 分 析 ：8.5μL?PCR?產 物 加 入0.5?μL?Spe Ⅰ及 1.5?μL?10×Buffer，37℃水浴 4?h，酶切產物用2%的瓊脂糖電泳檢測分型：顯示1條帶（503??bp）的為 AA 型，顯示 2 條帶（277?bp、226?bp）的為 BB 基因型，顯示 3 條帶（503?bp、277?bp、226?bp）為 AB 基因型。

1.6 數據處理

整理基因型數據，計算所測豬群體OPN和BMP15基因不同基因型的基因型頻率、基因頻率，用SPSS13.0分析產仔數在各基因型間的差異顯著性，數據用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 基因型頻率和基因頻率

根據OPN、BMP15基因型檢出個數，計算基因型頻率和基因頻率，見表1。OPN基因AA型頻率最大，BB型頻率最小，AB在兩者之間，且A等位基因占優勢，分別為0.673和0.327；BMP15基因BB型較少，AA型最多，A基因頻率為0.613，為優勢等位基因。

2.2 OPN和BMP15基因與產仔數關系

根據大長雜交一代豬群中OPN基因和BMP15基因各基因型及其合并基因型檢出個數和對應的經產產仔數資料，計算OPN基因和BMP15基因與產仔數關系。

從表2可以看出，BB型產仔數比AA型高1.717頭，產活仔數比AA型高1.223頭；不同基因型間產仔數表現出BB＞AB＞AA的趨勢。AA型與BB型對豬的產仔數差異極顯著（P＜0.01）,但對豬的產活仔數差異顯著（0.01＜P＜0.05）。

由表3可以看出，AA和AB型個體對豬的產仔數和產活仔數均高于BB型個體，AA型與AB型、BB型對豬的產仔數和產活仔數差異顯著（0.01＜P＜0.05），AB型與BB型差異不顯著（P＞0.05）。

從表4可以看出，BMP15和OPN合并基因型中BBBB合并基因型對豬的產仔數、產活仔數最高，分別為12.750和11.500；BBAA合并基因型產仔數、產活仔數最低，產仔數只和BBAA、ABAA合并基因型差異不顯著（P＞0.05），和其他合并基因型差異極顯著（P＜0.01）。

表1 OPN和BMP15基因的基因型分布和頻率

表2 OPN基因與產仔數的關系

表3 BMP15基因與產仔數的關系

表4 BMP15和OPN合并基因型與產仔數的關系

3 討論

OPN基因的多態性非常豐富，有研究表明，骨調素基因啟動子區存在9個（TG）n雙核苷酸的交替重復序列，是骨調素基因轉錄速率的主要區域[5]。Liaw[6]在約克夏、杜洛克、盤克夏和藍瑞斯母豬群體中共發現27種基因型；Southwood發現了13個等位基因。此外，在OPN基因的內含子上也存在多態，Knoll[3]研究發現豬OPN基因的第6內含子上有305?bp的缺失，并發現長白豬、皮特蘭豬上A等位基因占優勢（0.57和0.82）,而大白豬和杜洛克豬的B等位基因占優勢（0.74和0.84）。而本實驗結果表明A和B兩個等位基因在大長雜交一代母豬群體中均有分布，且A等位基因占優勢；就基因型分布而言，AA基因型頻率最大，BB基因型頻率最小，AB在兩者之間；從表2可以看出，BB和AB型個體對豬的產仔數高于AA型個體。這與羅仍卓么等[5]的研究指出的在長白和大白豬種中，OPN優良基因型為BB型是一致的。

關于BMP15基因位點對繁殖性能的影響已有相關報道，許多研究表明在綿羊中BMP15基因突變雜合體能引起排卵數的增加。儲明星等[7]研究表明BMP15FecXG突變雜合基因型小尾寒羊平均產羔數比野生純合基因型多0.62只或0.55只。侯振平等[4]研究發現，AA型母豬群體中，二花臉、梅山豬的產仔數和產活仔數極顯著高于BB型母豬群體；AB型梅山豬群，頭胎產仔數和產活仔數極顯著高于AA型和BB型母豬群體。本研究中，BMP15基因的3種基因型個體都檢測到了。另外，本研究表明，大長雜交一代豬的不同基因型母豬的總產仔數和產活仔數間差異顯著，從表3可以看出，AA產活仔數比BB高1.335頭；不同基因型間產仔數表現出AA＞AB＞BB的趨勢。這與侯振平等[4]和吳井生等[6]的研究指出的在梅山和大白豬種中，AA型母豬的產仔數和產活仔數顯著高于BB型母豬群體是一致的。

從表4可以看出，BMP15和OPN合并基因型中AABB和BBBB合并基因型產仔數、產活仔數均高于其它合并基因型，BBBB合并基因型最高，理論上應是AABB合并基因型的最高，在本次研究中卻是BBBB合并基因型最高，這可能因為BBBB合并基因型的樣本量太少有關，頭數只有4個，其與產仔數的關系需進一步加大樣本量。BBAA合并基因型產仔數、產活仔數最低；這與理論上是一致的。因此，對于OPN基因而言，B等位基因均可視為增加產仔數的優勢基因。這和單獨應用OPN基因型的分析結果[8]一致。對于BMP15基因而言，A等位基因可視為增加產仔數的優勢基因。

從本次檢測結果來看，被檢測的大長雜交一代豬BMP15基因的有利基因A頻率較高，為0.613；但是OPN基因的有利基因B頻率較低，僅為0.327；在隨后的育種生產實踐中，我們將根據基因檢測結果，結合產仔記錄和生產性能，選擇OPN為BB基因型和BMP15為AA基因型的母豬和后備豬，改善生產母豬繁殖力的遺傳基礎，加快繁殖力性狀的遺傳進展，增加母豬的窩產仔數，以提高生產水平和經濟效益。

[1]?Yin?Li,?He?Z?Q?and?Zhong?G.Osteopontin,?it′ s?receptor?and?the?reproduction?(J).?Progressin?Obstetrics?and?Gynecology,?2005,14(3):239 ～ 240

[2]?吳井生，朱孟玲.骨形成蛋白15基因BcuI多態性對豬產仔性能的影響［J］.畜牧與獸醫，2009，41（3）：19.

[3]?Knoll? A,? Stratil? A,? Cepica? S? and? Dvorak? J.?Lengthpolymorphism?in?an?intron?of?the?porcine?osteopontin?(SPP1)gene?is?caused?by?the?presence?or?absence?of?a?SINE?(PRE-1)element?(J).?Animal?Genetics,?1999,?30:466

[4]?候振平，印玉龍，等.豬骨形成蛋白15基因編碼區序列的克隆及測序研究［J］.廣西農業科學，2006，25（2）：91.

[5]?羅仍卓么，王立賢，孫世鐸.豬OPN基因與繁殖性狀的關聯分析［J］.農業生物科技學報，2008，16（3）：412-416.

[6]?Liaw?R?B,?Chang?H?L,?Lai?Y?Y,?Liu?C?T?and?Wu?M?C.? Influence? of? sows'? osteopontin? alleles? to? their? litter?performance?(J).Journal?Chinese?Society?of?Animal?Science,?2000,?29(Suppl.):?131

[7]?儲明星，桑林華，王金玉，等.小尾寒羊高繁殖力候選基因BMP15和GDF9的研究[J].遺傳學報，2005，32（1）：38-45.

[8]?孟慶利，劉鐵錚.豬骨調素基因多態性對產仔性狀的影響［J］.家畜生態學報，2005，26（3）：13-16.