白毛藤誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制研究

(牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江牡丹江157011)

白毛藤(Solamum lyratum Thunb),又名白英、毛鳳藤等,系茄科植物白英的全草,全草及根入藥,具有祛風(fēng)濕、解毒消腫、抗癌的作用[1]。國內(nèi)外研究表明,其對多種體外腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[3-4],但對其有效成分及其抗腫瘤機(jī)制,尤其是分子水平機(jī)制研究尚未見進(jìn)一步報道。本研究擬觀察白毛藤水提液對BGC-823細(xì)胞是否具有增殖抑制活性及誘導(dǎo)凋亡作用,并初步探討其分子水平機(jī)制,為白毛藤抗癌新藥的開發(fā),奠定一定的理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞株(武漢中美科技有限公司),RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),Trizol(Sigma公司),引物核苷酸片段(上海生工生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗分組 按白毛藤水提液的濃度分為4組:對照組:含BGC-823細(xì)胞的 RPMI-1640培養(yǎng)液;實驗組:RPMI-1640培養(yǎng)液倍比稀釋的4,8,16mg/mL的白毛藤水提液。

1.3 MTT比色法測定細(xì)胞增殖抑制率 每個藥物濃度設(shè)12個平行孔,每孔細(xì)胞密度為1×105個/mL,分別培養(yǎng)12、24和48 h后,加入MTT培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入 150 μ L二甲基亞砜,酶標(biāo)儀測定490 nm各孔的(OD)值。比色時以培養(yǎng)液調(diào)零。按公式計算細(xì)胞生長抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 取癌細(xì)胞,加0.25%胰酶消化細(xì)胞。制備3×105個/mL細(xì)胞懸液,每孔接種1 mL。將蓋玻片置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的白毛藤水提液;對照組加同體積培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h。胰酶消化,冷PBS 3遍沖洗,固定液10 min固定,棄去,雙蒸水 3遍沖洗,干燥,Hoechst3325837℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min,將孔中的蓋玻片取出,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 提取腫瘤細(xì)胞總RNA,以提取的總RNA為模板,設(shè)計引物如下:Bcl-2基因引物,上游 :5′-GACTTCTCGTCGCTACCGTC-3′;下游 :5′-TGCACCTACCCAGCCTCCCTTATC-3′;296bp。Fas基因引物,上 游:5′-CGCCTATGGTTGTTGACC-3′;下 游 :5′-CCTTCTGTTACAGACCTC-3′;產(chǎn)物長度 477bp。β-action基因引物,上游 :5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′,下游 :5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′;產(chǎn) 物 長 度838bp。PCR反應(yīng)30個循環(huán),95℃預(yù)變性5 min,94℃50s,55℃退火1 min,72℃延伸1min,72℃復(fù)性7 min。β-action作為陽性對照,待測基因mRNA表達(dá)相對值=待測基因mRNA光密度/β-action mRNA光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示,進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定BGC-823細(xì)胞增殖能力 白毛藤水提液作用時間延長,對BGC-823細(xì)胞增殖抑制的作用增強(qiáng),48 h各組細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)(P＜0.01);白毛藤水提液濃度增加,對細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng),16 mg/mL時作用最明顯(P＜0.05)。白毛藤水提液抑制胃癌細(xì)胞的增殖,具有明顯的濃度和時間依賴性(表1)。

表1 各組胃癌BGC-823細(xì)胞增殖情況(±s)mg/mL

表1 各組胃癌BGC-823細(xì)胞增殖情況(±s)mg/mL

注:與4 mg/mL白毛藤實驗組比較,##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg/mL)生長抑制率/%12 h 24 h 48 h對照組 — — — —實驗組 4 6.16±0.11 9.03±0.85 19.30±1.52實驗組 8 24.44±0.23##28.32±0.98##48.20±1.05##實驗組 16 42.51±0.44##71.35±5.23##86.89±1.02##

2.2 細(xì)胞凋亡情況檢測 熒光顯微鏡觀察不同濃度白毛藤水提液作用48 h后,細(xì)胞凋亡情況,不同劑量實驗組見凋亡細(xì)胞增多,凋亡細(xì)胞呈碎塊狀致密濃染,或細(xì)胞核致密濃染(圖略)。

2.3 各組BGC-823 Fas和Bcl-2基因表達(dá)水平 與對照組比較,不同濃度白毛藤作用48 h后,腫瘤細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)降低,Fas基因mRNA表達(dá)增加,以16 mg/mL組最明顯(表2)。

表2 各組Bcl-2和Fas表達(dá)情況(±s) mg/mL

表2 各組Bcl-2和Fas表達(dá)情況(±s) mg/mL

注:與對照組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg/mL) Bcl-2/β-Actin Fas/β-Actin對照組 — 0.85±0.02 0.27±0.01實驗組 4 0.66±0.04 0.39±0.02實驗組 8 0.34±0.02## 0.63±0.05##實驗組 16 0.26±0.01## 0.74±0.06##

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤之一,化學(xué)治療是最常用的治療方式,但存在嚴(yán)重的機(jī)體的損傷和耐藥性。而抗腫瘤中藥不易產(chǎn)生耐藥性,機(jī)體的損傷較小,因此,從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物具有非常重要的意義。

細(xì)胞凋亡為生理性細(xì)胞死亡方式,是在機(jī)體的精密調(diào)節(jié)下的細(xì)胞按部就班地死亡過程,又稱程序性細(xì)胞死亡(Programed cell death,PCD)。其異常與多種疾病密切相關(guān),如腫瘤、免疫疾病等。相關(guān)基因分為3類型:(1)細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)基因;(2)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因;(3)抑制細(xì)胞凋亡的基因。促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因,Fas屬TNFR/NGFR家族,定位于人染色體10q24.1,其產(chǎn)物是分子量45kd的跨膜蛋白,它與其天然配體膜蛋白Fas-L(分布于T效應(yīng)細(xì)胞)結(jié)合,從而細(xì)胞內(nèi)傳遞“分子信號”,誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡[5-6]。白毛藤水提液可以明顯上調(diào)胃癌細(xì)胞Fas基因表達(dá),隨著藥物濃度的增加,腫瘤細(xì)胞中Fas基因表達(dá)逐步上調(diào),與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明Fas與胃癌生長密切相關(guān),白毛藤水提液可能通過上調(diào)Fas,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡,抑制胃癌細(xì)胞的生長。抑制細(xì)胞凋亡的基因,Bcl-2定位于人染色體18q21.3,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[7-10],Bc1-2在多種腫瘤的細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用,Bc1-2與調(diào)節(jié)蛋白Bax形成二聚體,Bc1-2/Bax比率高時,Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果證實,白毛藤水提液可以明顯下調(diào)胃癌細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá),隨著白毛藤水提液藥物濃度的增加,腫瘤細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)逐步下調(diào),與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。白毛藤水提液可通過下調(diào)Bcl-2,抑制細(xì)胞凋亡,從而影響腫瘤細(xì)胞的生長。

綜上所述,白毛藤水提液可能通過調(diào)控Bcl-2及Fas基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。然而,其具體有效成分及其抗癌機(jī)制有待進(jìn)一步的實驗研究。

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