川芎嗪抑制大鼠局灶性腦缺血損傷神經元凋亡的作用

柳朝陽 孫 鵬 苗 志 張 濤 王建杰

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154007)

川芎嗪為中藥川芎的有效成分,化學結構為四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TMP),在體內吸收后,能有效透過血腦屏障,并廣泛分布大腦皮層、腦干、紋狀體、海馬、小腦和中腦等部位。近十幾年來,TMP擴張血管的機制已有許多研究〔1〕。本研究采用川芎嗪干預大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血(MCAO)模型,動態(tài)觀察神經細胞的形態(tài)改變以及 bcl-2蛋白表達情況,探討川芎嗪對局灶性腦缺血損傷神經保護的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 川芎嗪注射液 40 mg/2 ml(北京第四制藥有限公司生產,批號 20060701),TUNEL染色試劑盒及 bcl-2蛋白免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 成年健康雄性 Wistar大鼠 36只,參照 Longa等〔2〕的大腦中動脈線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型。缺血 2 h后,將栓線向外輕輕拉出,恢復供血,形成再灌注。手術動物清醒后,出現左側 Horner征、右側前肢肢體無力、肌張力降低則提示 MCAO模型制作成功。模型制作成功后,按照隨機原則,首先分為缺血再灌注組(18只)和川芎嗪治療組(18只),兩組在腦缺血 2 h后再灌注 6、12、24 h共 3個時間點各分為 3個亞組,每組 6只大鼠。治療組大鼠在 MCAO模型制備成功后分別腹腔注射川芎嗪 40 mg/kg;缺血組在相同時間點均腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 標本制備 再灌注后相應時間點對各組模型動物以2ml 10%水合氯醛腹腔注射麻醉至深度昏迷,迅速開胸暴露心臟,以 100 ml肝素生理鹽水經主動脈弓快速灌注沖洗,隨后以 4%多聚甲醛 PBS緩沖液(4℃,p H7.4)經主動脈弓灌注 30 min。迅速取腦,冠狀切開腦組織,取視交叉前后約 0.5 mm處的組織,置于上述固定液中 24 h。常規(guī)石蠟包埋,于視交叉處連續(xù)冠狀切片,片厚 5μm,切片置于 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 TUNEL染色檢測原位細胞凋亡 取已制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、雙氧水處理、蒸餾水洗滌后嚴格按照說明書逐步進行,使用DAB顯色試劑盒,著棕黃色為陽性細胞。

1.5 免疫組化染色檢測 bcl-2蛋白表達 嚴格按照試劑盒說明書逐步進行操作,胞質呈棕黃色或棕褐色為陽性細胞。

1.6 鏡下觀察 400倍光學顯微鏡下每張切片隨機觀察 5個不重疊視野,計數陽性細胞數,取平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理 所有實驗數據均用 x±s表示,采用 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1 TUNEL染色原位細胞凋亡檢測結果 見表 1和圖 1。隨著再灌注時間的增加,缺血再灌注組凋亡細胞逐漸增多(P＜0.05);再灌注各時間點,與缺血再灌注組相比,川芎嗪治療組凋亡細胞數明顯減少 (P＜0.01)。

2.2 免疫組化染色檢測 bcl-2表達情況 見表 2和圖 2。隨著再灌注時間的增加,缺血再灌注組 bcl-2陽性細胞逐漸減少(P＜0.05);再灌注各時間點,與缺血再灌注組相比,川芎嗪治療組 bcl-2陽性細胞數明顯增加(P＜0.05)。

圖1 實驗各組TUNEL染色凋亡細胞表達情況(DAB,×400)

圖2 實驗各組bcl-2蛋白表達情況(DAB,×400)

表1 各組凋亡細胞表達(個/高倍鏡視野,x±s,n=6)

表2 各組 bcl-2蛋白表達(個/高倍鏡視野,x±s,n=6)

3 討 論

缺血再灌注損傷的神經保護是目前國內外研究的熱點。急性缺血性腦梗死的治療主要是溶栓和神經保護相結合。溶栓在治療疾病的同時,也不可避免地引起再灌注損傷。如何最大限度減少再灌注損傷,更好地保護已經受損的神經細胞成為急需解決的問題。尋找研發(fā)一種有效、平穩(wěn)、安全的神經保護藥物為解決這一問題提供了契機。以往的神經保護藥物作用機制/靶點單一、副作用大、價格昂貴等原因,限制了其在臨床的應用。祖國的傳統(tǒng)醫(yī)學具有整體觀念的特點,中藥又具有復方特征,可以作用于多靶點,而且中藥來源廣泛、價格低廉。鑒于此,越來越多的研究者把目光投向了傳統(tǒng)中藥。

細胞凋亡是缺血后神經細胞丟失的一種主要形式,但有關腦缺血后細胞凋亡的確切機制尚不清楚。研究表明,細胞凋亡過程受多種基因調控,其中原癌基因 bcl-2是調節(jié)細胞凋亡的最基本成員,被認為是能特異性抑制細胞凋亡發(fā)生的抗凋亡基因。bcl-2蛋白為 26 k D的細胞內膜蛋白,定位于內質網膜、線粒體膜和核膜。體內外實驗均表明,bcl-2蛋白能抑制多種因素誘發(fā)的細胞凋亡。腺病毒介導的bcl-2高表達可阻止或延緩各種刺激誘導的神經元死亡〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)、環(huán)己酞亞胺(cycolhxeimide)都可通過誘導 bcl-2表達對抗缺氧 NO誘發(fā)的神經元凋亡。由此可見,bcl-2表達水平可能是調節(jié)神經元存活的主要因素。Martinou等用轉基因技術使小鼠神經元內 bcl-2過度表達,梗死灶減少了 50%,證實了 bcl-2具有神經元保護作用〔4〕。最近研究發(fā)現 bcl-2轉染到梗死周圍區(qū)域能夠阻斷核凋亡誘導因子的轉位,從而提高皮層神經元的存活〔5〕。

bcl-2作為細胞凋亡調節(jié)網絡中最重要的蛋白,影響或被影響著其他細胞凋亡相關基因和分子,如 TGF-β、Hsp 70、ICE、Myc及 p53等。bcl-2表達具有多種生理活性,可以阻止或降低射線、自由基、化學藥物等引起的細胞凋亡,對氧化損傷造成的細胞凋亡具有肯定的抑制作用。其抗凋亡的機制迄今仍不是很清楚。但多數研究者認為:①bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用主要是直接對抗各種脂質的過氧化反應〔6〕;②抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質,如細胞色素 c和凋亡誘導因子〔7〕,目前認為,bcl-2減少缺血后神經元的丟失主要是通過阻斷細胞色素 C的釋放和 caspase-3的活化來加以實現的〔8〕;③抑制 Bax,bcl-xs等促凋亡基因作用的發(fā)揮;④抑制富含半胱氨酸蛋白酶的激活〔9〕;⑤bcl-2過度表達可直接或間接引起線粒體膜的超極化,以維持細胞內鈣離子的穩(wěn)態(tài)。在凋亡過程中,凋亡蛋白酶發(fā)揮著與核酸內切酶同樣重要的作用。而位于線粒體膜的 bcl-2蛋白可阻止細胞色素C和APaf的相互作用從而使凋亡蛋白酶激活受阻,因而可阻止細胞色素 C介導的細胞凋亡〔10,11〕。本實驗結果顯示,腦缺血再灌注損傷可導致神經元凋亡,隨著再灌注時間的增加凋亡細胞逐漸增多,再灌注各時間點,與缺血再灌注組相比,川芎嗪治療組凋亡細胞數明顯減少;腦缺血再灌注神經元中 bcl-2蛋白陽性細胞結構清晰、形態(tài)基本正常;再灌注各時間點,川芎嗪治療組bcl-2蛋白陽性細胞數明顯多于再灌注缺血對照組,提示川芎嗪能抑制腦缺血再灌注損傷導致的神經元凋亡。其機制可能是通過增加腦缺血再灌注損傷神經元 bcl-2蛋白表達,從而對腦缺血損傷發(fā)揮保護作用。

川芎嗪是一種臨床治療藥物,與其他實驗藥物相比較,其臨床試驗相對安全易于開展,研究前景較為樂觀。但其對腦缺血再灌注損傷的其他保護機制及最佳治療劑量、有效治療時間窗等問題尚待進一步研究。

1 楊光田,李樹生,鄧普珍 .實驗動物復蘇及低氧時川芎嗪對心腦的作用〔J〕.中國急救醫(yī)學,1997;17(1):7.

2 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

3 Tabira T.Singifieance of intraeellular a beta in Alzheimer′s disease〔J〕.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi,2002;22(5):175-80.

4 Hossmann KA.Viability thresholds and the penumbra of focal ischemia〔J〕.Annals Neurol,1994;36(4):557-65.

5 Mies G,Iijima T,Hossmann KA.Correlation between peri-infarct DC shifts andischemic neuronal damage in rat〔J〕.Neuroreport,1993;4(6):709-11.

6 Makresbery WR,Lovell MA.Four-hydroxynonenal,a product of lipid peorxidation,is increased in the brain in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Aging,1998;19l:33-6.

7 Ahn YH,Koh JY,Hong SH.Protein synthesis-de pendent but bcl-2-independent cytochrome Creleasec in zin-c depletion-induced neuronal apoptosis〔J〕.JNeurosci Res,2000;61(5):508-14.

8 李 軍,曾邦雄 .腦缺血損傷級聯反應的研究進展〔J〕.國外醫(yī)學?麻醉學與復蘇分冊,2001;22(6):364-8.

9 王巧稚,劉廣益,郭 勇 .淀粉樣前體蛋白與阿爾茨海默病神經細胞凋亡的關系〔J〕.四川解剖學雜志,2003;11(2):32-4.

10 Nakatsuka H,Ohta S,Tanaka J,et al.Cytochrome release from mitochondria tothe cytosol was suppressed in the ischemia-tolerance-induced hippocampal CAI region after 5-min forebrain ischemia in gerbils〔J〕.Neurosci Lett,2000;278(1-2):53-6.

11 Antonwaieh FJ.Translocation of cytochrome c following transient global ischemia in the gerbil〔J〕.J Neurosci Lett,1999;274(2):123-6.