人參二醇組皂苷對人膠質瘤 U251細胞增殖與凋亡的影響

周麗琴

(北華大學附屬醫院神經內科,吉林 吉林 132013)

人參為五加科多年生草本植物,其成分具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射等多種生物活性作用〔1〕。人參皂苷是人參中主要的有效成分,迄今已確定結構的至少在 30種以上,人參二醇組皂苷(PDS)即是其中一種,具有抗缺血再灌注損傷、清除氧自由基、抗氧化、阻滯鈣通道等多種生物學效應〔2,3〕。本研究通過觀察 PDS體外對 U251細胞增殖及凋亡的影響,探討其抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 PDS由吉林大學藥學院天然藥物分析實驗室提取;四甲基偶氮唑藍(MTT)為美國 Sigma公司產品;激活的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9多克隆抗體購于Takara公司,順鉑為山東齊魯制藥廠生產。

1.2 細胞系及培養條件 人膠質瘤細胞株 U251(中科院上海細胞生物化學研究所提供)培養在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養液中,置 37℃、5%CO2濕化的培養箱中,待細胞長滿 80%培養瓶時,分組加藥。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 RPMI1640空白對照組(A組);2μmol/L順鉑組(陽性對照組,B組);PDS低劑量(50 mg/L)組(C組)、中劑量(100 mg/L)組(D組)、高劑量(200 mg/L)組(E組)。

1.3.2 細胞形態觀察 取對數生長期細胞,調整細胞密度為1×105接種于 24孔板,1 ml/孔。培養過夜后換新鮮的培養液,按前述分組加藥,48 h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 MTT比色法 在 96孔培養板,接種細胞 1×105/孔,每組 4孔,加藥孵育 20 h及 44 h后每孔加 MTT(5 g/L)20μl,繼續孵育 4 h吸棄培養液,每孔加入 DMSO 100μl,震蕩 10 min,用酶標儀(波長 570 nm)測定各孔吸光度值(A),計算細胞生長抑制率,抑制率≥30%為細胞對該藥敏感。抑制率 =(對照組A值 -給藥組 A值)/對照組 A值 ×100%。

1.3.4 吖啶橙染色 將 10 mg吖啶橙溶于 100 ml、pH值為6.8的PBS中,過濾后 4℃避光保存。細胞爬片經不同藥物處理后,加入 20μl吖啶橙儲存液,熒光顯微鏡下觀察,拍照。

1.3.5 流式細胞儀檢測 傳代培養的U251細胞接種于培養瓶中(1×106/瓶),次日加藥處理,48 h后收集細胞,冷 PBS洗2次,-20℃、70%的冷乙醇固定,加入 115 ml PI(50 mg/L)染色。混勻后上流式細胞儀做單參數分析,用累積曲線分割法計算各期細胞比例。

1.3.6 免疫細胞化學染色 將大小適合的蓋玻片放入 6孔培養板中,接種細胞為 5×105/孔,37℃、5%CO2中培養,次日加藥,繼續培養 48 h,PBS清洗,4%多聚甲醛固定,免疫細胞化學技術觀察細胞內激活的caspase9表達情況。

1.4 統計學處理 數據處理采用SPSS9.0統計軟件,數據以x±s表示,組間比較采用 χ2檢驗。

2 結 果

2.1 PDS對 U251細胞生長的影響

2.1.1 細胞形態觀察 A組細胞貼壁能力強,細胞生長旺盛,形態完好。經PDS處理 48 h后,D、E組細胞形態均發生明顯改變,即細胞呈現類圓形,周緣毛糙不規則,胞質中顆粒較多,貼壁能力下降,且出現懸浮細胞和細胞碎片,以E組較為突出,48 h后C組也可見少許死亡細胞出現。表明中,高劑量PDS體外可以抑制 U251細胞生長。見圖 1。

2.1.2 不同藥物對U251細胞增殖抑制作用 隨著PDS濃度增加和作用時間的延長,細胞增殖抑制率逐漸增高,且呈明顯時間、劑量依賴性。見表 1。

2.2 細胞凋亡檢測

2.2.1 吖啶橙染色 A組細胞呈均勻綠色,形態規則,未見凋亡細胞;D、E組細胞出現不規則橘黃色熒光,細胞體積變小,胞核皺縮,呈現凋亡細胞的形態改變,且個別細胞胞膜破裂。見圖2。

2.2.2 流式細胞術結果 與 A組相比,給藥 48 h后,D、E組在 G1期前出現明顯凋亡峰,呈現劑量依賴關系。見表 2。

2.2.3 細胞免疫化學結果 A組細胞 caspase9表達弱陽性,經 PDS處理的細胞casapae9表達明顯上調,胞質中出現大量的棕黃色顆粒,隨時間延長,劑量增加陽性細胞數增多,染色增強。見圖 3。

表1 不同時間PDS對 U251細胞的增殖抑制率(%)

表2 給藥48 h PDS對U251細胞周期及凋亡率的影響(%)

圖1 不同藥物處理U251細胞 48 h后形態學改變(×200)

圖2 不同藥物處理U251細胞 48 h后吖啶橙染色結果(×200)

3 討 論

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤,約占顱內腫瘤的 46%,占成年人全身腫瘤的 2%;惡性膠質瘤的發病率為(5～8)/100萬,在 1998年WHO公布的按死亡率順序排位中,惡性膠質瘤為 34歲以內患者的第 2位死亡原因,35～60歲患者的第 3位死亡原因〔4〕。膠質瘤浸潤廣泛,手術極難全切,具有高發病率,高致殘率和高死亡率,目前臨床治療效果難以令人滿意。目前尚缺乏有效的治療手段。尋找新的治療手段成為神經外科的研究熱點之一。

本實驗通過 MTT法觀察細胞生長抑制情況,用吖啶橙染色和流式細胞儀測定細胞凋亡和細胞周期改變。結果表明,PDS對人 U251細胞在體外有抑制作用,且隨劑量的增長,作用時間延長,抑制作用增強。生長抑制試驗中,當藥物濃度為200mg/L時,抑制率達 37.26%,表明 U251細胞經 PDS處理后體外生長受到明顯的抑制作用。

正常細胞周期中存在周期調節控制點,而癌細胞的細胞周期失去了周期控制點的調節,可以無限增殖。如果藥物能恢復周期控制點的作用,使腫瘤細胞在任何一個環節出現障礙使其細胞不能得到增殖〔5〕。本實驗流式細胞儀檢查結果分析表明,200mg/L PDS可使細胞大部分阻滯于S期,延緩由 S期進入G2期,因此細胞增殖能力大大限制。近年來研究表明,許多抗癌藥物均能誘導腫瘤細胞發生凋亡,這可能是這些藥物抑制腫瘤生長的機理之一。

已知 caspase家族是細胞凋亡發生核調控的重要因素,caspase家族中又以 caspase-9為最重要的調節分子〔6〕。本研究通過免疫組化結果發現,空白對照組 U251細胞只有少量激活的 caspase-9蛋白表達,而 PDS可上調 caspase-9表達且呈現劑量依賴關系。表明 PDS可能激活了細胞內線粒體依賴途徑的激活 caspase-8,然后作用于 Bid(Bcl-2 inhibitory BH 3-domaincontaining protein),形成有活性的tBid(truncated BID),tBid使線粒體釋放 Cytochrome C,Cytochrome C再與 Apaf-1和 Procaspase-9形成復合體激活 caspase-9,激活了的 caspase-9再通過caspase-9、7,降解細胞骨架蛋白,使 U251細胞凋亡〔7,8〕,至于PDS誘導 U251凋亡的信號轉導通路的具體機制尚需進一步探討,PDS抗膠質瘤細胞增殖的特性有可能開發成為治療膠質瘤的輔助藥物。

1 國家藥典委員會 .中藥大辭典〔M〕.上海:上海科技出版社,2000:3-5.

2 王建春,孫曉霞,王 志,等 .人參二醇組皂苷對內毒素休克大鼠腦皮質 TLR4mRNA表達的影響〔J〕.中國病理生理學雜志,2005;21(12):2431-3.

3 李 峰,郭聰慧,李 揚,等 .人參二醇組皂苷對大鼠有絲分裂原反應性的影響〔J〕.免疫學雜志,2004;20(3):243-5.

4 Mischel PS,Cloughesy TF.Targeted molecular therapy of GBM〔J〕.Brain Pathol,2003;13(1):52-61.

5 Viola S,Consoli GM,Merlo S,et al.Inhibition of rat glioma cell migration and proliferation by a calixarene scaffold exposing multiple Glc NAc and ureido functionalities〔J〕.J Neurochem,2008;107(4):1047-55.

6 Gdynia G,Grund K,Eckert A,et al.Basal caspase activity promotes migration and invasivenessin glioblastoma cells〔J〕.Mol Cancer Res,2007;5(12):1232-40.

7 Bhattacharjee M,Acharya S,Ghosh A,et al.Bax and Bid act in synergy to bring about T11TS-mediated glioma apoptosis via the release of mitochondrial cytochrome c and subsequent caspase activation〔J〕.Int Immunol,2008;20(12):1489-505.

8 Stegh AH,Kesari S,Mahoney JE,et al.Bcl2L12-mediated inhibition of effector caspase-3 and caspase-7 via distinct mechanisms in glioblastoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2008;105(31):10703-8.