肌動蛋白和神經元特異性烯醇化酶在腺樣囊性癌中表達的免疫電鏡研究

張 凡 常永霞 劉春秀 李瑞平

(河北北方學院附屬第一醫院病理科,河北 張家口 075000)

腺樣囊性癌(ACC)是一種常見的涎腺惡性腫瘤,極易沿神經生長并侵襲神經,其嗜神經侵襲性及其跳躍性生長使 ACC的徹底治療極為困難,因此研究 ACC的嗜神經侵襲性具有重要意義。腫瘤細胞的神經膜分化可能與其侵襲神經有關,而且通過神經膜細胞標記物神經細絲酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色,發現ACC的嗜神經侵襲可能與ACC細胞發生了神經膜細胞分化有關,但由于光鏡觀察的局限性,究竟 ACC中是否存在神經元特異性烯醇化酶(NSE)的表達仍有待研究。務外神經侵犯可能與腫瘤細胞向神經主動運動有關,而肌動蛋白(MA)則是目前細胞胞質內標記物,與細胞存在運動功能密切相關,為了證實 ACC中的神經膜細胞分化與肌上皮細胞的關系,本研究采用免疫電鏡技術從超微水平觀察 NSE和MA在ACC中的表達,為神經侵犯的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 14例 ACC標本取自本院 2007年 1月至 2007年 10月頜面外科住院手術患者,男性 8例,女性 6例,平均年齡 45.3歲;經術前活檢病理證實,其中實體型 5例,篩狀型 6例,混合行 3例,神經侵犯 1例;術中避開壞死區切取標本后立即固定于 0.05%戊二醛與 4%多聚甲醛中 2 h。

1.2 實驗步驟 標本固定 2 h后即進行振動切片,30%蔗糖沖洗液沖洗 4h,液氮凍融,0.1mol/LPBS緩沖液洗 30min,5%牛血清白蛋白和 5%羊血清封閉 1.5h,切片加入小鼠抗人 NSE多克隆抗體和小鼠抗人MA單克隆抗體后于常溫下過夜(一抗均用 5%牛血清白蛋白和 5%羊血清配制)。第 2天,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min后加入二抗(IgG2膠體金復合物),常溫下放置 1 d。第 3天,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min,2%戊二醛固定 45 min,去離子水洗 7次,銀加強,去離子水洗 7次,0.1mol/L PBS緩沖液洗30min,0.5%鋨酸固定 1 h,0.1 mol/L PBS緩沖液洗 30 min,梯度脫水,于EPON812環氧樹脂包埋劑中過夜。第 4天,EPON812環氧樹脂包埋,并于 37℃、45℃及60℃下各聚合 12、12、24 h。第 7天,光鏡下定位,超薄切片,切片厚度為 70nm,最后切片經醋酸鈾和檸檬酸鉛復染后,電鏡下觀察。每例標本各取 2張切片分別采用 0.1 mol/L PBS緩沖液代替一抗作空白對照。

1.3 試劑和儀器 NSE多克隆抗體(DAKO,丹麥,工作濃度1∶50)、小鼠抗人 MA單克隆抗體 (DAKO,丹麥,工作濃度1∶50),日本電子 JEM2100型電子顯微鏡。

2 結 果

2.1 光鏡觀察 光鏡下半薄切片觀察腫瘤細胞,可見大小不等的細胞巢或實心團塊,部分標本上皮細胞巢內有許多圓形腔隙,形成篩孔狀結構,有的腫瘤細胞形成實心團塊和篩狀兩種結構;MA陽性細胞和NSE陽性細胞均散在分布于腫瘤細胞巢中或環形分布于篩孔狀結構的周邊,其中神經侵犯的腫瘤細胞呈現 MA和NSE的強陽性表達。

2.2 電鏡觀察 腫瘤主要由 2種形態不同的細胞組成,一類為立方狀細胞,細胞輪廓比較規則,胞核呈圓形和卵圓形,這類細胞 NSE和MA抗體均為陰性(圖 1)。另一類細胞形態多樣,有的呈多角形,有的呈梭形,多數均可見細長的胞質突起,這類細胞多數能被抗 MA抗體和抗 NSE抗體所標記,MA陽性細胞的膠體金顆粒主要位于細胞質中,它們多數具有梭形的細胞核以及細長的胞質突起(圖 1)。NSE陽性細胞的膠體金顆粒同時位于細胞核與細胞質內(圖 1)。這類細胞的共同特征為細胞核形態不規則,多數呈梭形,與細胞質突起的長軸平行,胞質內可觀察到平行的肌微絲結構(圖 1)。

圖1 ACC細胞超微結構

3 討 論

ACC是頜面外科常見的一種惡性腫瘤,盡管腫瘤細胞大多呈現高分化,卻極易侵襲神經,呈跳躍式轉移,臨床上常有面癱,感覺障礙等神經受損癥狀,給臨床治療帶來很大困難。因此研究該腫瘤神經侵犯和轉移機制意義重大。

NSE可從正常人腦中分離獲得,在星形神經膠質細胞及其腫瘤中存在,還見于各類型的星形細胞、膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經鞘瘤以及一些具有神經內分泌功能的腫瘤中,并被用作神經膜細胞的特異性標記物之一。ACC主要有兩種細胞來源導管內襯上皮細胞和肌上皮細胞。究竟是ACC中哪種成分發生了神經膜細胞分化,目前并不清楚。其中肌上皮細胞是一種兼具上皮和間葉組織結構和功能表型的細胞,它屬上皮來源,但結構與平滑肌類似,含有 MA,具有收縮功能,肌上皮細胞還含有微管結構,具有與神經軸突某些相似的結構特點,能參與神經沖動的傳導,但目前并無肌上皮細胞出現神經細胞樣分化的報道。Toth等〔1,2〕曾通過光鏡對比觀察 ACC和多形性低度惡性腺癌,認為ACC中某些腫瘤細胞和多形性低度惡性腺癌中變異的肌上皮細胞形態上與神經膜細胞相似,提出這些細胞在腫瘤發生演變過程中發生了神經膜細胞分化,但他既沒有進行肌上皮細胞的特異性染色,也沒有通過超微結構辨認,這樣的結論顯然是沒有說服力的。我們研究顯示所有 14例標本均呈現 NSE陽性表達,而且在神經侵犯病例中出現高表達。因此我們證實腫瘤中有部分細胞出現了神經分化,在篩狀的周邊尤為明顯。

MA是目前最常用的肌上皮細胞標記物,本實驗發現在ACC中,神經膜細胞標記物NSE陽性細胞與MA陽性細胞具有相似的超微結構,這種超微結構符合 Redman歸納的肌上皮細胞的超微結構特點,即具有細長的細胞突起、梭形的細胞核、細胞核與細胞的長軸或最長的細胞突起平行、胞質內平行排列的微絲〔3～5〕。因此我們推測 ACC中發生神經膜細胞分化的應該是其中的肌上皮細胞成分。而這些腫瘤性肌上皮細胞發生神經膜細胞分化,表現出神經膜細胞的某些特性,進而可以直接與神經膜細胞表面受體識別結合,使ACC具有了嗜神經侵襲的能力,同時腫瘤細胞仍保留肌上皮的運動特性,因此腫瘤細胞與神經膜細胞黏附后會一直沿神經束遷移,這可能是ACC嗜神經侵襲的組織學基礎。

ACC的神經侵犯特性可能與其他腫瘤在間質中的浸潤轉移有相似之處,細胞間的黏附狀態會隨腫瘤發展的不同階段發生變化。最新研究顯示:ACC中肌上皮細胞的神經分化可能表達多種神經細胞表面的多種受體〔6,7〕,但受體的表達水平肯定隨神經侵犯過程不斷發生變化,需要今后更加深入研究證實。

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