青藤堿對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷后 Bcl-2和 caspase-3表達的影響

吳 嵐 周素嫻 劉開祥 俸軍林 李清華

(桂林醫學院附屬醫院,廣西 桂林 541001)

在糖尿病高血糖情況下,缺血性腦損傷加重可能與乳酸堆積、興奮性氨基酸、自由基、Ca2+超負荷及細胞凋亡等有密切關系。青藤堿(Sin)是從中藥青風藤中提取的生物堿單體。它具有抗炎、免疫抑制、鎮痛、降壓、抗心律失常等藥理作用。前期研究證實,青藤堿對正常血糖大鼠缺血再灌注腦損傷有保護作用〔1〕,但機制未明。本實驗通過建立糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,研究Sin對其 Bcl-2和 caspase-3蛋白表達的影響,探討其保護作用的可能分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型建立及實驗動物分組 健康 Wistar大鼠,雄性,清潔級,共 50只,體質量(250±30)g(廣西醫科大學動物實驗中心提供)。大鼠喂飼高脂飼料(1%膽固醇,10%豬油,0.2%丙硫氧嘧啶,89%基礎飼料〔2〕)。 4 w后,單次空腹腹腔注射 30mg/kg鏈脲佐菌素(購于 Sigma公司),繼續高糖高脂飼料喂養,于注射后 1、2個月測定體重和血糖〔3〕。選擇非空腹血糖 16.7～25.6 mmol/L的大鼠作為造模成功的糖尿病大鼠。經檢測模型成功大鼠共 45只,將其中 40只大鼠按隨機分組原則分為假手術組(10只)、缺血再灌注組(10只)、Sin低劑量治療組(10只)及 Sin高劑量治療組(10只)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 Sin低劑量治療組(30 mg/kg)和高劑量治療組(60mg/kg)均于術前30 min分別給予大鼠腹腔注射,假手術組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水腹腔注射。缺血再灌注組和 Sin低、高劑量治療組建立腦缺血 90 min再灌注 24 h動物模型。

1.2.2 腦缺血再灌注損傷模型的建立 參照 Longa等〔4〕方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。神經功能缺陷評分:各組分別在再灌注 24h進行評分。0分:正常,無神經學征象;1分:動物不能完全伸展右前肢;2分:動物右側肢體癱瘓,行走時向右側轉圈,出現追尾現象;3分:動物行走向右側跌倒,或動物不能站立或動物打滾;4分:無自發活動,有意識障礙。神經功能缺陷評分在 1～3分為模型成功。

1.2.3 Bcl-2和 caspase-3表達的免疫組化染色 再灌注24h,各組隨機取 5只大鼠,用生理鹽水和多聚甲醛進行心臟灌流固定,斷頭取腦。在左側大腦半球距離嗅球尖端 7～11 mm之間冠狀切取約 5 mm厚腦組織塊,固定、脫水、包埋成臘塊,連續切片,厚 5μm。連取 5張,1張作 HE染色,觀察病理形態學改變。其余 4張作免疫組化染色。用SP法進行Bcl-2和 caspase-3蛋白的免疫組化染色。一抗由北京中山生物技術有限公司提供。陰性對照片用 PBS液代替一抗。在細胞質內出現棕黃染色顆粒代表 Bcl-2和caspase-3蛋白陽性表達細胞。于每個鼠腦取 1張切片,每張切片分別隨機選取左側大腦半球額頂部皮質 5個不重復高倍鏡視野(×400),計數每個視野陽性細胞數,算出平均數即為每張切片陽性細胞數。

1.2.4 TTC染色 再灌注 24 h,將各組另外 5只大鼠深麻后開顱取腦。將鼠腦置于 -4℃冰箱 20 min后,將其切成 5等份冠狀位切片,置于 2%TTC溶液中,水浴、多聚甲醛液固定。用計算機病理圖像分析儀及梯形法計算出梗死灶體積,各腦片梗死灶體積之和即為梗死體積。左側大腦半球梗死灶區呈白色,主要為額頂部皮質和尾殼核,正常組織呈紅色。部分組織表現為由白色向紅色過渡區。

1.3 統計學方法 數據處理采用 SPSS11.5統計軟件進行分析,結果以 x±s表示,組間差異顯著性檢驗采用方差分析。

2 結 果

2.1 各組Bcl-2表達的比較 假手術組可見 Bcl-2呈少量表達。缺血再灌注組 Bcl-2陽性細胞表達增多,部位主要分布于缺血周邊區的額頂皮質,與假手術組比較,差異有統計學意義(P＜0.05),見圖 1。與缺血再灌注組比較,Sin高、低劑量治療組的 Bcl-2陽性細胞均明顯增加(P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見表 1。

圖1 Bcl-2和 caspase-3的免疫組化圖(SP,×400)

2.2 各組 caspase-3蛋白表達的比較 假手術組 caspase-3呈少量表達。缺血再灌注組caspase-3陽性細胞表達增多,部位主要分布于缺血周邊區額頂皮質和海馬組織,與假手術組比較,差異有統計學意義(P＜0.05),見圖 1。與缺血再灌注組比較,Sin高、低劑量治療組的caspase-3陽性細胞明顯減少(P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見表 1。

表1 各組 Bcl-2、caspase-3表達和腦梗死體積的比較(x±s,n=5)

2.3 各組腦梗死體積的比較 大鼠腦缺血再灌注 24 h TTC染色:TTC染色后,缺血再灌注 24 h左側大腦半球梗死灶區呈白色,主要為額頂部皮質和尾殼核,正常組織呈紅色。部分組織表現為由白色向紅色過渡區。Sin高、低劑量治療組梗死體積較缺血再灌注組減小(均 P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見圖 2。

圖2 缺血再灌注損傷腦梗死TTC染色

2.4 各組缺血側腦組織病理學改變的比較 假手術組腦組織切片可見神經細胞、膠質細胞及毛細血管形態正常,結構完整,錐體細胞核大而圓,核仁明顯。缺血再灌注組呈缺血改變,梗死區正常組織結構消失,結構不清,間質水腫,有炎細胞浸潤;錐體細胞體積縮小,細胞核固縮深染,胞漿嗜伊紅。部分細胞壞死,并可見呈篩狀壞死的壞死灶。Sin不同劑量治療組腦組織缺血改變較缺血再灌注組明顯減輕,壞死范圍縮小,細胞結構較完整,細胞核固縮減少,細胞間質水腫輕,高劑量組與低劑量組之間比較,缺血改變更輕。

3 討 論

研究發現 Sin可治療正常血糖的腦缺血再灌注大鼠,顯示青藤堿對缺血再灌注腦損傷有保護作用〔1〕。但具體機制尚不清楚。本實驗結果也表明,糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷給予不同劑量的 Sin治療,可明顯減少腦梗死體積,減輕缺血造成的病理損害,并且高劑量Sin的腦保護效果更顯著。

在腦缺血急性期,神經元壞死與凋亡并存,細胞壞死位于缺血中心區,細胞凋亡主要出現在缺血半暗帶。Bcl-2基因是一種癌基因,它所編碼的膜相關蛋白是一種強有力的細胞死亡抑制因子,它在調節神經元凋亡過程中發揮著抑制凋亡的關鍵作用。目前認為 Bcl-2是與腦缺血神經元凋亡關系最密切的內源性凋亡抑制基因〔5〕。 Lawrence等〔6〕在過度表達 Bcl-2基因的轉基因小鼠中發現,Bcl-2蛋白能減輕大腦中動脈阻塞引起的缺血性腦損傷,使腦梗死體積縮小。本實驗結果顯示,Bcl-2蛋白在糖尿病大鼠假手術組腦組織中幾乎沒有表達,但在缺血再灌注后,Bcl-2則出現了表達,主要出現在缺血半暗帶的額頂皮質,我們推測這是機體對抗凋亡的一種反應。而Sin治療組大鼠腦組織中 Bcl-2蛋白的表達明顯高于缺血再灌注組,表明Sin可能通過上調 Bcl-2蛋白的表達從而對缺血再灌注腦損傷起到一定的保護作用。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases)是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后實施是通過 caspases的激活而實現的。caspases的激活表現為“瀑布式”的級聯反應,而 caspase-3是 caspases級聯反應中下行的最關鍵的凋亡執行蛋白酶,在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐的作用〔7〕,它的激活可通過裂解 DNA依賴性蛋白激酶等,改變其結構,促使細胞凋亡〔8〕。有研究發現〔9,10〕在缺血性神經損傷過程中,抑制caspase-3活性可產生明顯的神經保護作用。本研究表明,Sin通過降低 caspase-3的表達與活化,可減少再灌注期神經元凋亡的發生,從而促進腦缺血后神經元的存活。

本實驗研究表明,Sin增加缺血再灌注后Bcl-2蛋白表達同時抑制 caspase-3蛋白表達,對凋亡有抑制作用。近年有研究表明〔11〕,缺血半影區 Bc1-2過度表達可以抑制 caspase-3的活性,關于 Sin是否通過對 Bc1-2的激活抑制 caspase-3蛋白表達發揮腦保護作用機制我們還將做進一步探討。

1 吳 嵐,劉開祥,俸軍林,等.青藤堿對鼠腦缺血再灌注損傷環氧化酶-2表達及前列腺素 E2含量的影響〔J〕.中國康復醫學雜志,2009;24(4):293-6.

2 李儀奎,王欽茂 .中藥藥理實驗方法學〔M〕.上海:科學技術出版社,1991:398.

3 李愛卿,王志慧,趙躍斌 .高糖高脂飼料誘導 2型糖尿病大鼠模型〔J〕.臨床醫藥實踐雜志,2005;14(2):2-3.

4 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5 GrahamSH,ChenJ,Clark RS.Bcl-2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury〔J〕.J Neurotrauma,2000;17:831-41.

6 Lawrence MS,Ho DY,Sun GH,et al.Over expression bcl-2 with Herpes simplex virus vectors protects CNSneurons against neurological insults in vitro and vivo〔J〕.JNeuroscience,1996;6(2):394-6.

7 Faubel S,Edelstein CL.Caspases as drug targetsin ischemic organ injury〔J〕.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord,2005;5(3):269-87.

8 Wellington CL,Hayden MR.Caspases and neurodegeneration:on the cutting edge of new therapeutic approaches〔J〕.Clin Genet,2000;57(1):1-7.

9 Loetscher H,Niederhauser O,Kemp J,et al.Is caspase-3 inhibition avalid therapeutic strategy in cerebral ischemia〔J〕?Drug Discov Today,2001;6(13):671-80.

10 Li H,Colbourne F,Sun P,et al.Caspaseinhibitors reduceneuronal injury after focal but not global cerebra lischemia in rats〔J〕.Stroke,2000;31(1):176-82.

11 Zhao H,Yenari MA,Cheng D,et al.Bc1-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome C translocation and caspase-3 activity〔J〕.Neurochem,2003;85:1026-36.