辛伐他汀對高脂血癥大鼠心肌細胞內質網應激相關凋亡的影響

周 平 李法琦 張 彬 常曉東 甘 華 陳力學

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科,重慶 400016)

高脂血癥可誘發(fā)、加重心肌缺血再灌注引起心肌細胞凋亡〔1〕,心肌細胞凋亡在心肌重構及心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。內質網應激(ERS)作為細胞凋亡的新機制,參與心肌肥厚合并心力衰竭的心肌細胞凋亡過程〔2〕,我們推測 ERS也可能參與高脂血癥導致的心肌細胞凋亡的過程。辛伐他汀不僅通過調脂和穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊在心腦血管病防治中發(fā)揮重要的作用,而且通過激活一氧化氮合酶和磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶 B(PI3-K/Akt)細胞的信號途徑發(fā)揮調脂外心臟保護作用〔3～5〕,但辛伐他汀能否通過調節(jié) ERS抑制高脂血癥誘導的心肌細胞凋亡還未見相關的報道。本研究建立高脂血癥大鼠模型,觀察心肌細胞凋亡和ERS信號通路分子——葡萄糖調節(jié)蛋白(GRP)78的表達并采用辛伐他汀進行干預,探討辛伐他汀對高脂血癥大鼠 ERS相關心肌細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性 Wistar大鼠 24只,4周齡,體重 200～250g。高脂飼料配方為:2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽鹽、5%蛋黃、0.2%的丙硫氧嘧啶、82.3%基礎飼料。動物及基礎飼料均由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 辛伐他汀(舒降之)購自杭州默沙東公司,兔抗大鼠 GRP78抗體購自美國Santa Cruz公司,SABC免疫組化試劑盒、TUNEL試劑盒購自武漢博士德,RT-PCR試劑盒購自 TaKaRa公司;其余為國產分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立與分組 普通飼料分籠飼養(yǎng) 1 w適應實驗室條件后,大鼠隨機分成 3組,每組 8只:①正常對照組:普通飼料喂養(yǎng);②高脂血癥組:高脂飼料喂養(yǎng);③辛伐他汀組:在高脂飼料喂養(yǎng)基礎上給予辛伐他汀 10 mg?kg-1?d-1灌胃,持續(xù) 12w。

1.3.2 標本采集 12w時,取各組大鼠的尾靜脈血,使用全自動化生化儀檢測血清中膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量。確定造模成功后,斷髓法處死動物,消毒大鼠胸部,開胸腔迅速取出心臟,沿室間隔分離左心室,沿左心室最寬處垂直于長軸留取的心肌組織一部分置于 4%多聚甲醛固定,另取 0.5 g心肌組織于 EP管中置于液氮保存,待提取總 RNA,剩余心肌組織置 -80℃冰箱保存。

1.3.3 心肌組織的病理學檢測 4%多聚甲醛固定標本,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(4μm)后,行 HE染色,光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理學改變。

1.3.4 心肌細胞凋亡的檢測 TUNEL法檢測心肌組織的心肌細胞凋亡,操作步驟嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。光鏡下正常心肌細胞核呈藍色,凋亡心肌細胞核呈棕黃色。每一切片選取 5個視野,在 200倍高倍鏡下,計算陽性細胞數,并計算凋亡指數(CAI)。CAI=(陽性細胞數目/計數細胞總數)×100%。

1.3.5 免疫組織化學法檢測心肌組織中 GRP78的表達 切片常規(guī)脫蠟至水,微波修復抗原,用 1∶1 000稀釋的兔抗大鼠GRP78抗體孵育,在4℃條件下過夜。PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG-辣根過氧化酶,作用 30 min。DAB顯色,復染后封片。細胞質著棕黃色者為陽性表達細胞,細胞質無棕色或與背景色一致者為陰性。

1.3.6 RT-PCR法檢測心肌組織GRP78基因的表達水平 應用上 游引物 5′-AGTGGTGGCCACTAATGGAG-3′、下 游引物 5′-CATGGTAGAGCGGAACAGGT-3′,擴增 GRP78編碼的基因,預計產物的長度為 289 bp。擴增 β-actin的引物為:上游 5′-AGTGGTGGCACTAATGGAG-3′,下游 5′-TCTTTT-GTCAGGGGTCGTTC-3′,預計擴增產物長度 696 bp。 PCR的反應條件為:94℃3 min,94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,35個循環(huán),72℃延伸10 min。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件包,數據以 x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應用 q檢驗。

2 結 果

2.1 血脂水平的變化 與正常對照組比較,高脂血癥組大鼠血清 TC和TG水平均顯著升高(P＜0.01);與高脂血癥組比較,辛伐他汀組大鼠血清 TC和 TG水平明顯降低但仍高于正常對照組,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 大鼠血清 TC、TG水平(x±s,mmol/L,n=8)

2.2 心肌組織病理學的改變 光鏡下可見正常對照組心肌細胞排列規(guī)則、心肌細胞邊界清晰、細胞核完整;高脂血癥組心肌細胞排列紊亂、邊界不清、心肌纖維斷裂、部分細胞核溶解消失;辛伐他汀組心肌纖維排列稍疏、細胞核溶解較少,心肌損傷程度介于正常對照組與高脂血癥組之間。見圖 1。

2.3 心肌細胞凋亡檢測 正常對照組偶見心肌細胞凋亡,心肌細胞 CAI為(2.6±0.25)%,高脂血癥組心肌細胞 CAI為(38.37±0.65)%,高于正常對照組(P＜0.05),辛伐他汀組心肌細胞 CAI為(14.57±0.27)%,低于高脂血癥組(P＜0.05)但仍高于正常對照組(P＜0.05)。見圖 2。

2.4 心肌組織GRP78蛋白表達水平 免疫組化結果顯示,正常對照組心肌 GRP78有微量表達,平均光密度值為(0.052±0.013,n=8);高脂血癥組GRP78蛋白呈強陽性表達,胞漿內充滿棕黃色顆粒,平均光密度值(0.232±0.030,n=8)明顯高于正常對照組(P＜0.05);辛伐他汀組GRP78蛋白呈弱陽性表達,平均光密度值(0.145±0.016,n=8)明顯低于高脂血癥組。見圖 3。

2.5 心肌組織 GRP78基因的表達水平 正常對照組 GRP78 mRNA表達較低,其平均灰度值為(0.192±0.004,n=8)。高脂血癥組GRP78mRNA的表達明顯高于正常對照組,具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05),其平均灰度值為(0.784±0.024,n=8);與高脂血癥組比較,辛伐他汀組 GRP78 mRNA的表達明顯減少(0.421±0.012,n=8)但仍高于正常對照組,均有顯著統(tǒng)計學差異(P均 ＜0.05)。見圖 4。

圖1 12 w時各組大鼠心肌病理改變(HE,×400)

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡(DAB,×200)

圖4 RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織GRP 78的表達水平

3 討 論

高脂血癥是一種常見的血脂代謝紊亂,且是心腦血管疾病發(fā)病的獨立危險因素之一,其發(fā)病率逐年上升。研究發(fā)現,高血脂可以激活內皮細胞、單核細胞等多種炎癥細胞,導致脂質過氧化反應產生大量的自由基,從而引起心肌細胞的功能障礙甚至心肌細胞損傷〔6,7〕;高脂血癥也可以通過降低內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達使一氧化氮合成減少,從而導致心肌細胞損傷〔8〕。臨床研究也發(fā)現,血液中高脂肪酸含量能夠降低心肌細胞的葡萄糖代謝及心肌對缺氧的耐受性〔9〕。本文在高脂血癥大鼠模型中發(fā)現,高脂血癥組大鼠血清TC和 TG水平顯著增高的同時,其心肌組織發(fā)生結構紊亂且心肌細胞凋亡顯著增加,提示高脂血癥具有直接的心肌細胞毒性,可以導致心肌細胞和心肌組織的結構損傷和功能障礙。

內質網是參與細胞內蛋白質合成后折疊與聚集、細胞應激反應及細胞內鈣離子水平的細胞器。ERS是由某種原因導致的內質網生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細胞器病理過程,可加強內質網對蓄積在網腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白質的處理,有利于維持細胞的正常功能并使之存活,但長時間的ERS可引起細胞凋亡〔10〕。由 ERS誘發(fā)的細胞凋亡有 3種細胞信號途徑:①CHOP/GADD153基因激活轉錄途徑;②JNK激活途徑;③內質網特有的半胱氨酸蛋白酶 caspase-12激活途徑。GRP78、GRP94、ERP29等蛋白是內質網分子伴侶蛋白,是發(fā)生ERS反應的重要標志性分子〔11〕。研究發(fā)現,在腹主動脈縮窄術后,大鼠發(fā)生心肌細胞凋亡的同時伴有 GRP78表達增多〔12〕;腹主動脈結扎(TAC模型)引起心肌重構過程中,GRP78、GRP94、CHOP/GADD153的表達均上調〔13〕;缺血再灌注損傷引起心肌細胞凋亡過程中,ERS的標志性分子也大量表達〔14〕。這些研究都證實 ERS參與心肌細胞凋亡和心肌重構的發(fā)生與發(fā)展。本文研究表明,高脂血癥大鼠模型心肌組織排列紊亂,GRP78在基因及蛋白水平表達均上調,心肌細胞凋亡率顯著增加,提示高脂血癥激活了 ERS相關的細胞凋亡信號途徑,誘導心肌細胞凋亡和心肌組織結構異常,與文獻報道一致。

辛伐他汀屬于羥甲基戊二酸單酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,它不僅能夠調節(jié)血脂水平,還具有清除氧自由基、抑制細胞黏附分子表達和改善血管內皮功能等作用。新近研究還發(fā)現,在前腦缺血再灌注損傷模型中,辛伐他汀可以通過減弱 ERS發(fā)揮神經細胞保護作用〔15〕。本文在高脂血癥大鼠模型中發(fā)現,辛伐他汀不但可以顯著降低高脂血癥大鼠的血脂(包括 TC和TG)水平,而且顯著大鼠的心肌細胞凋亡并且下調心肌組織 ERS標志性分子GRP78的表達,提示辛伐他汀可能通過干預 ERS途徑抑制高脂血癥誘導的心肌細胞凋亡并改善其心肌組織結構從而發(fā)揮心臟保護作用。

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