銀杏葉提取物對糖尿病大鼠腦組織的保護作用

楊旭芳 趙永光 楊云芳

(牡丹江醫學院病理生理學教研室,黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病微血管病變所致的糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)主要表現為認知障礙,即記憶力減退、分析解決問題的能力與學習能力均下降。關于 DE的預防與治療,還未找到可靠有效的藥物,目前對心血管系統具有保護作用的傳統中藥銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract,EGb)對DE的預防及其對腦組織的保護作用少有報道,故本研究應用鏈脲佐菌素(STZ)建立大鼠糖尿病(DM)模型,觀察EGb對實驗性DM大鼠血糖、血胰島素、血漿內皮素(ET)及腦組織中 ET含量變化及治療前后腦組織內 ET表達的影響,旨在探討 EGb對 DM大鼠腦損傷的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 EGb購自北京雙鶴天然藥物有限公司,血糖試劑盒購自南京建成生物研究所。胰島素、ET放免分析試劑盒購自中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。STZ購自華美生物工程公司北京分公司。

1.2 動物及分組 選用 Wistar大鼠 40只,由本院動物室提供,雌雄各半,體重 200～250 g,大鼠禁食 16～18 h,自由飲水,隨機取 30只經尾靜脈注射 STZ(30 mg/kg),2 w后,做葡萄糖耐量實驗(OGTT),篩選糖耐量異常者共 22只喂以高熱量飲食,隨機分為DM組和EGb,每組 11只。治療組按 8 mg/kg劑量腹腔注射 EGb,1次/d;DM組大鼠每日腹腔注射同體積生理鹽水;另 10只大鼠以普通飼料喂養,作為正常對照組,亦每日腹腔注射同體積生理鹽水。三組均連續注射 8w。

1.3 血液樣本的采集 大鼠空腹在乙醚麻醉下,內眥靜脈取血約 6 ml,2 000 r/min離心 15 min,取分離血清貯存于 -20℃冰箱中,用于測定血清葡萄糖、胰島素、ET。

1.4 腦組織勻漿的制備 取部分腦組織,用預冷生理鹽水反復蕩洗 3次,濾紙吸干,稱重后置于玻璃勻漿器中,用冷凍處理的生理鹽水將此標本制成 1∶10的組織勻漿,4 000～6 000 r/min離心 15 min,取上清液備用。

1.5 腦組織 ET mRNA表達的檢測 把預留的腦組織快從-70℃冰箱中取出,取合適大小的組織快,放入預先用液氮預冷的研缽中研磨組織,加入 500μl Trizol,使其充分裂解,分別從三組中抽提總 RNA,RT-PCR檢測 ET的表達。引物序列為ET:正義 5′-TTTTCCCTCCTCTTCTTCTGAT-3′;反義 5′-ACTTCTTGTCTTTTTGGTGAGC-3′;β-actin:正 義 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′;反 義 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。 并利用圖像分析軟件(IDImage Analysis Software)分析PCR產物/β-actin灰度比值。

1.6 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件進行分析,數據用x±s表示,組間差異的顯著性用 t檢驗。

2 結 果

2.1 EGb對DM大鼠血糖的影響 實驗 10 w時,DM組大鼠表現出糖耐量異常的變化(P＜0.05),1 h血糖增高顯著(P＜0.01)達高峰,2 h血糖仍較高;正常對照組大鼠 30 min血糖達到峰值,2 h血糖基本恢復正常。10 w時治療組則表現出糖耐量異常有明顯改善。見表 1。

表1 實驗 10w時血清葡萄糖水平(mmol/L,x±s)

2.2 血清胰島素水平的改變 實驗結束測定三組大鼠胰島素水平,DM組高于對照組 〔(50.90±13.63)vs(34.11±5.82)μU/ml〕(P＜0.01),經 EGb治 療后,胰島素水平〔(40.96±6.41)μU/ml〕顯著下降(P＜0.05),見表 2。

2.3 血漿及腦組織ET含量的測定 DM組大鼠血漿及腦中ET含量高于對照組(P＜0.01),經 EGb治療后,血漿及腦中 ET含量則低于 DM組(P＜0.05)。見表 2。

表2 實驗 10w時血漿與腦組織中 ET含量比較(x±s,pg/ml)

2.4 腦組織ET mRNA的表達 RT-PCR檢測結果顯示,三組均見 ET mRNA表達,正常組 ET/β-actin為 0.426±0.002,DM組為 2.402±0.001,治療組為 1.102±0.001,治療組 ET mRNA表達較 DM組明顯下調。見圖 1。

圖1 RT-PCR檢測ET mRNA的表達

3 討 論

EGb是目前國內外藥物治療缺血性心腦血管病中的常用藥物,其有效成分主要為銀杏黃酮苷類和萜烯內酯類生物活性物質,具有清除氧自由基、抑制 NO的產生等作用〔1〕,還能舒張血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心腦等器官血液循環〔2,3〕。

DE是由于 DM糖代謝紊亂導致腦血管改變,損害中樞神經系統,使大腦在結構、神經生理及精神等方面發生病理改變,以獲得性認知行為缺陷為特征的 DM慢性并發癥〔4,5〕,有關DM腦神經細胞損傷的機制尚未明確,但一般認為與高血糖引起的代謝紊亂、氧自由基的作用以及血管內皮功能異常,促進ET的釋放,最終導致血管舒張功能受損有關〔6〕。ET主要由內皮細胞產生,是血管內皮損傷的標記物,也是迄今發現的最強大、持續時間最長的血管收縮肽。

EGb具有顯著的降糖、降低血漿胰島素水平、清除氧自由基作用,本實驗前期結果已闡述了EGb降糖、胰島素、抗氧化應激的可能機制與其對胰島的修復及清除自由基、抗脂質過氧化作用有關〔7〕,本次結果顯示實驗性 DM大鼠血漿及腦組織內ET的含量較對照組顯著升高,這與戴自英等報道一致〔6〕。但經 EGb治療后,ET水平明顯下降,且腦組織內 ET mRNA水平表達下調,提示EGb降低ET的作用是通過抑制 ET基因表達實現的,具體的信號轉導途徑目前還不清楚,這將是下一步的研究目標,將為充分利用 EGb,開發一類用于預防和治療 DM以及 DE的有效制劑提供依據。

1 La Casa C,Villegas L,Alarcon de la Lastra C,et al.Evidence for protective and antioxidant properties of rutin,a natural flavone,against ethanol induced gastric lesions〔J〕.JEthnopharmacol,2000;71(1-2):45-53.

2 Kubota Y,Tanaka N,Umegaki K,et al.Ginkgo biloba extract-induced relaxation of rat aortais associated with increase in endothelial intracellular calcium level〔J〕.Life Sci,2001;69(20):2327-36.

3 Nishida S,Satoh H.Comparative vasodilating actions among terpenoids and flavonoids contained in Ginkgo biloba extract〔J〕.Clin Chim Acta,2004;339(1-2):129-33.

4 田國慶,梁曉春.糖尿病性腦病〔J〕.中國康復理論與實踐,2003;9(10):635-6.

5 Biessels Gj,van der Heide LP,Kamnal A,et al.Ageing and diabetes:implications for brain function〔J〕.Eur J Pharmacol,2002;441(1-2):1-14.

6 戴自英,陳灝珠.實用內科學〔M〕.第 11版 .北京:人民衛生出版社,2001:953.

7 鄒 輝,楊旭芳,郭尚福 .銀杏葉提取物對實驗性 2型糖尿病大鼠心肌的保護作用〔J〕.牡丹江醫學院學報,2007;28(6):9-11.