阿魏酸鈉對博來霉素肺纖維化大鼠肺組織TGFβRmRNA表達的影響

穆茂 程德云 聶莉 楊禮騰 胡曉波 方詢 陳文彬

阿魏酸鈉對博來霉素肺纖維化大鼠肺組織TGFβRmRNA表達的影響

穆茂 程德云 聶莉 楊禮騰 胡曉波 方詢 陳文彬

目的 觀察阿魏酸鈉對肺纖維化大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA表達的影響，探討其治療肺纖維化的作用及機制。方法 將30只SD大鼠隨機分為對照組，肺纖維化模型組和阿魏酸鈉治療組，每組10只。模型組和治療組以氣管內滴入博來霉素(5mg/kg)建立肺纖維化動物模型，治療組采用阿魏酸鈉(150mg/kg體重)灌胃治療。HE染色檢測肺組織病理改變，免疫組化檢測Ⅰ型膠原纖維，原位雜交檢測轉化生長因子β受體ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)。結果 與對照組比較，肺纖維化模型組肺組織Ⅰ型膠原纖維顯著增加(P＜0.001)。阿魏酸鈉治療組與肺纖維化模型組比較，肺組織內1型膠原纖維表達減弱(P＜0.001)，TGFβRⅡmRNA表達降低(P＜0.05)。結論 阿魏酸鈉能有效地減輕肺纖維化大鼠肺組織的纖維化程度，其機制可能與其抑制肺內TGFβRⅡmRNA的表達，從而阻止Ⅰ型膠原過度沉積有關。

阿魏酸鈉；肺纖維化；1型膠原纖維；轉化生長因子βⅡ受體

肺纖維化主要的發病機制是復雜的細胞因子網絡調控失衡導致膠原纖維代謝失衡。其中，轉化生長因子β1(TGFβ1)在其細胞因子網絡失衡調控中起著關鍵作用[1]。TGFβ1主要是通過與成纖維細胞上的TGFβRⅡ結合從而激活TGFβ/Smads信號轉導通路，使膠原過度沉積導致肺纖維化的發生發展。在治療上，主要給予腎上腺糖皮質激素和免疫抑制劑，但效果不甚理想且副作用明顯，而具有活血化淤功效的中藥在防治器官纖維化方面具有良好的前景。近年來有研究顯示，阿魏酸鈉對大鼠肝纖維化和腎間質纖維化具有一定的抑制作用[2-3]，但關于阿魏酸鈉能否抑制肺纖維化，目前報道較少。有鑒于此，我們以大鼠氣管內滴入博來霉素建立肺纖維化模型，通過分析阿魏酸鈉對大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA及Ⅰ型膠原纖維表達的影響，初步探討阿魏酸鈉對肺纖維化的療效，為其治療肺纖維化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物和試劑：選擇7周齡二級健康SD大鼠30只 (四川大學華西實驗動物中心提供)，體重150g～250g，雌雄各半；阿魏酸鈉(成都亨達藥業有限公司)；博萊霉素(15mg/支)；麗春紅S(北京欣經科生物技術有限公司)，維多利亞蘭B(上海化學試劑公司)，兔抗大鼠Ⅰ型膠原抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；轉化生長因子TGFβ受體ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)②主要儀器：TE2000-u熒光相差倒置生物顯微鏡，COOLPIX450高級數碼相機，Imagepro plus專業圖像分析軟件。

1.2 將大鼠隨機分為3組 對照組、肺纖維化組和阿魏酸鈉治療組，每組10只大鼠。肺纖維化組和阿魏酸鈉治療組大鼠氣管內滴入博萊霉素(5mg/kg體重，溶于0.3ml生理鹽水)，建立肺纖維化模型。對照組予等量生理鹽水氣管內滴入。從第2天起，阿魏酸鈉治療組大鼠每天給予阿魏酸鈉(150mg/kg體重，溶于3ml生理鹽水)灌胃，肺纖維化組和對照組大鼠予以3ml生理鹽水灌胃,共28天。第29天，處死大鼠，剪下左肺下葉于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定后，常規石蠟包埋，切片，分別進行HE染色、免疫組化法(S-P法)檢測I型膠原纖維，原位雜交試檢測TGFβRⅡmRNA。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。圖像采集及分析定量：利用由TE2000-u熒光相差倒置生物顯微鏡，COOLPIX450高級數碼相機，Image-proplus專業圖像分析軟件構成的圖像采集和分析系統，于免疫組化切片的上下左右四個視野各采集一張100倍的圖像，每張圖像先進行顏色分離，然后自動計算肺組織內Ⅰ型膠原纖維的積分光密度(IOD)值，4張圖像的IOD平均值作為該片肺組織內Ⅰ型膠原纖維的IOD代表值。對于TGFβRⅡmRNA原位雜交切片，同樣先用軟件進行顏色分離，然后采用相同的方法計算肺組織TGFβRⅡmRNA的IOD代表值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，所測數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理改變和細胞數采集結果 對大鼠肺組織HE染色切片進行觀察可見，對照組肺組織結構正常，肺泡間隔無明顯充血及水腫，肺泡內未見明顯炎性細胞。模型組肺泡間隔明顯增寬伴明顯充血水腫，重度纖維組織增生，肺泡腔變形，其中含有較多炎性細胞。阿魏酸鈉治療組肺泡結構基本正常，肺泡間隔增寬較模型組明顯減輕，炎性細胞浸潤較輕，纖維化改變不明顯。

2.2 免疫組化檢測Ⅰ型膠原纖維結果 對照組I型膠原纖維僅在氣管周圍弱表達；而在模型組中，I型膠原纖維廣泛分布于支氣管上皮下組織、肺間質及血管周圍；經過阿魏酸鈉治療后，表達于支氣管上皮下組織、肺間質及血管周圍的Ⅰ型膠原纖維明顯減少。模型組Ⅰ型膠原纖維的表達(0.97±0.34)明顯高于對照組(0.27±0.08)(P＜0.001)；阿魏酸鈉治療組(0.39±0.25)較模型組表達減弱，差異有顯著性(P＜0.001)，而與對照組比較沒有明顯差異(P＞0.05)。結果見表1。

2.3 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA比較 原位雜交染色可見，對照組肺組織形態正常，可見少許散在炎性區，TGFβRⅡmRNA表達較少。模型組肺組織肺泡壁明顯增厚，在增厚的肺泡壁及血管周圍可見明顯TGFβRⅡmRNA表達；阿魏酸鈉治療組肺組織內TGFβRⅡmRNA表達降低。結果見表2。

表1 各組大鼠肺組織I型膠原纖維的表達情況(±s)

表1 各組大鼠肺組織I型膠原纖維的表達情況(±s)

注：與對照組比較 *P＜0.001**P＞0.05；與模型組比較，#P＜0.001

組別 樣本數 I型膠原纖維(IOD)對照組 9 0.27 ± 0.08模型組 10 0.97 ± 0.34*阿魏酸鈉治療組 9 0.39 ± 0.25 **#

表2 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA的表達情況(±s)

表2 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA的表達情況(±s)

注：與對照組比較 *P＜0.01**P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 樣本數 TGFβRⅡmRNA(IOD)對照組 9 0.078 ± 0.035模型組 10 0.178 ± 0.090*阿魏酸鈉治療組 9 0.121 ± 0.025**#

3 討論

肺纖維化的主要病理特點是早期的彌漫性肺泡炎和后期大量成纖維細胞的病理性增生及基質膠原纖維進行性積聚并取代正常肺組織結構[4]。膠原纖維是肺組織的細胞外基質的主要成分。正常情況下，肺內膠原代謝處于動態平衡，對維持肺間質和肺泡的正常結構和功能起著非常重要的作用。博萊霉素氣管內一次性注入制備的肺纖維化大鼠模型是目前公認的比較符合肺纖維化病理演變的模型[5]。本實驗中，HE切片顯示模型組肺泡組織明顯充血、水腫，表明模型組的纖維化程度嚴重。免疫組化顯示，對照組I型膠原纖維僅在氣管周圍弱表達，而模型組I型膠原纖維廣泛分布于支氣管上皮下組織、肺間質及血管周圍，且表達較對照組有顯著差異(P＜0.001)。以上結果表明本實驗成功地復制了博萊霉素誘導的大鼠纖維化模型。

阿魏酸鈉是當歸、川芎等多種中藥的有效成分。藥理研究認為，阿魏酸鈉為非肽類內皮素受體拮抗劑，可拮抗內皮素引起的血管收縮、升壓及血管平滑肌細胞增殖的作用，從而可減輕血管內皮損傷；并且有抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學等作用。此外還具有清除自由基、增強免疫功能等多種藥理作用[6]。

本研究發現，阿魏酸鈉治療組肺組織的病理學改變較肺纖維化組有較大改善，纖維化程度明顯減輕；阿魏酸鈉治療組I型膠原纖維含量也較模型組明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.001)，這提示阿魏酸鈉具有一定的抗肺纖維化作用。

TGFβRⅡ是肺纖維化過程中炎性細胞因子TGF-β信號轉導通路上的一種細胞表面受體，為含有絲氨酸/蘇氨酸激酶的糖蛋白。TGF-β在細胞內轉導，先要與特異性Ⅱ型受體結合，通過形成受體四聚體復合物，繼而發揮細胞內TGF-β信號轉導作用。有研究報道，在動物實驗中，可溶性Ⅱ型受體抗體中和TGF-β可以阻止TGF-β與靶細胞上的受體結合，顯著減輕博萊霉素誘導的肺纖維化。

我們的結果顯示，經阿魏酸鈉治療后，TGFβRⅡmRNA的表達較模型組降低(P＜0.05)。進一步提示阿魏酸鈉可能通過減少TGF-β/Smads信號轉導通路中的關鍵受體分子TGFβRⅡmRNA的表達，抑制TGF-β細胞內信號轉導，使I型膠原纖維合成減少，從而起到抗纖維化的作用。

[1]Xaubet A,Marin-Arguedas,Lario S,et al.Transforming growth factor beta-1 gene polymorphisms are associated with disease progression in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respiratory&Critical Care Medicine2003,168(4):413-415.

[2]賀德,曾志良,曹建華,等.阿魏酸鈉抗大鼠肝纖維化[J].世界華人消化雜志,2002,10(2):240-241.

[3]陳輝珍,樊均明.阿魏酸鈉與腎間質纖維化關系的探討[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(5):353-355.

[4]王耀勇,徐啟勇,葉燕青,等IL-10在博萊霉素誘導大鼠所致肺纖維化中的作用[J]武漢大學學報(醫學版),2004, 25(2):159-165.

[5]Clark JG,Kostal KM,Marino BA.Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamster.An alveolar macrophage product increases fibroblast prostaglandin E2and cyclic adenosine monophosphate and suppresses fibroblast proliferation and collagen production[J].J Clin Invest,1983,72:2082-2091.

[6]劉向峰,李娜.阿魏酸鈉的臨床應用[J].寧夏醫學雜志,2005,27(1):69-70.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.21.057

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