銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥作用的研究

葉曉林，王沼丹，楊曉波

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 610044； 2.四川大學華西醫(yī)學中心，四川 成都 610044；3.四川省雙流縣中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610044）

銅綠假單胞菌是重要的條件致病菌，臨床上大量抗菌藥物使用導致的耐藥性上升，使得治療銅綠假單胞菌感染十分困難。因此，對臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥性進行有效監(jiān)測，研究聯(lián)合用藥治療銅綠假單胞菌引起的疾病，對于合理選用最佳治療方案具有積極意義。氟喹諾酮類（fluoroquinolones，F(xiàn)QNs）抗菌藥物臨床用于治療多種細菌感染，包括呼吸道、泌尿道等感染，隨著其廣泛使用，耐藥性也越來越嚴重。主動外排系統(tǒng)是導致銅綠假單胞菌耐藥的重要原因，其中銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排系統(tǒng)是迄今最具有臨床意義的藥物外排系統(tǒng)[1-2]。筆者研究了臨床分離的銅綠假單胞菌對FQNs的耐藥性及其機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：27株臨床分離的銅綠假單胞菌分別來自四川大學華西醫(yī)院傳染科，標準株ATCC27853由四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理教研室保存。

藥品及試劑：諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、司帕沙星（sparfloxacin，SPLX），均由中國藥品生物制品檢定所提供。LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，M-H肉湯培養(yǎng)基（浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗所），MH瓊脂平板。質(zhì)粒提取試劑盒，DNA分子量標準物、Taq酶和dNTP，聚合酶鏈式反應（PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、總RNA提取試劑盒，兩步法RT-PCR試劑盒，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）購自Sigma公司；其他試劑均為分析純（上海化學試劑廠）。

1.2 方法

最低抑菌濃度（MIC）的測定：用二倍稀釋法[3]測定 MIC。抗菌藥物的質(zhì)量濃度為 0.03，0.062，0.125，0.25 …… 64，128 mg/L，液體培養(yǎng)基中含菌量為1×105CFU/mL。MIC結(jié)果判斷參照National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）公布的標準，銅綠假單胞菌標準株ATCC27853為質(zhì)控株。

CCCP對 MIC的逆轉(zhuǎn)作用：在測定氟喹諾酮類藥物 MIC的同時，制備含有不同質(zhì)量濃度的喹諾酮類藥物和終質(zhì)量濃度為20mg/L CCCP的平板，測定CCCP是否對氟喹諾酮類藥物的體外抗菌活性有影響。若含CCCP的平板中測得的 MIC比單獨使用喹諾酮類藥物時相應的 MIC降低4倍或以上，則表明有主動外排機制的存在。

銅綠假單胞菌耐藥機制的研究：常規(guī)培養(yǎng)，離心收集菌體，提取銅綠假單胞菌染色體DNA、質(zhì)粒DNA以及細菌總RNA[4]。根據(jù)文獻提供的序列資料和方法，計算機輔助設計擴增銅綠假單胞菌oprM（GenBank accession number AE004676）和 mexR（GenBank accession number U23763）、qnr （GenBank accession number AY070235）基因的PCR引物[1]。mexR基因擴增，以DNA為模板，產(chǎn)物預計為498 bp片段；條件為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火54℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，進行30個循環(huán)后再72℃ 延伸7 min。質(zhì)粒qnr擴增，以質(zhì)粒DNA為模板，條件為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，進行30個循環(huán)后再72℃ 延伸7 min，產(chǎn)物預計為338 bp片段。oprM基因擴增，采用兩步法RTPCR擴增檢測其表達情況，以總RNA為模板，首先反轉(zhuǎn)錄，然后進行 PCR擴增，條件為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，進行30個循環(huán)后再72℃ 延伸7 min，產(chǎn)物預計為244 bp片段。用凝膠回收試劑盒純化mexR基因擴增產(chǎn)物，373A自動測序儀（Applied Biosystems）進行擴增產(chǎn)物的測序。

2 結(jié)果

2.1 耐喹諾酮銅綠假單胞菌的藥物敏感試驗

5種喹諾酮類藥物中沒有一種對27株銅綠假單胞菌敏感，且諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星的 MIC不小于64 μg/mL 的菌株數(shù)分別為 19，21，22，19，21 株，均出現(xiàn)了比較高的耐藥水平。MIC測定結(jié)果見表1。

表1 27株銅綠假單胞菌對氟喹諾酮類藥物的藥物敏感試驗結(jié)果[株（%）]

2.2 CCCP對MIC的逆轉(zhuǎn)作用

將27株耐藥株進行CCCP逆轉(zhuǎn)作用試驗，結(jié)果有3株耐諾氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有4株耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有5株耐氧氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有8株耐左氧氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有4株耐司帕沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)。結(jié)果見表2。

表2 CCCP對細菌耐藥的影響（MIC，mg/L）

2.3 銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排系統(tǒng)oprM基因及其表達

oprM基因的RT-PCR擴增結(jié)果：對臨床分離的13號及25號銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥株（主動外排耐藥株）的oprM基因進行了RT-PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1A。可見，13號及25號銅綠假單胞菌具有250 bp左右的條帶，標準敏感菌株擴增產(chǎn)物量少，說明oprM基因的高表達與細菌的主動外排多重耐藥有一定的關(guān)系。

MexAB-OprM系統(tǒng)的調(diào)節(jié)基因mexR基因測定：mexR基因表達結(jié)果見圖1B。可見，13號及25號銅綠假單胞菌具有500 bp左右的條帶。擴增產(chǎn)物測序結(jié)果表明，將mexR基因序列與gene bank中accession number U23763銅綠假單胞菌序列相比，25號耐藥株在編碼66位氨基酸處發(fā)生了堿基發(fā)生突變的情況（GCC→GTC，Ala→Val），但沒有檢測到堿基缺失，13號耐藥株則沒有發(fā)現(xiàn)堿基發(fā)生缺失和突變的情況。

質(zhì)粒qnr介導的銅綠假單胞菌耐藥分析：質(zhì)粒qnr基因經(jīng)PCR擴增后，電泳無條帶顯示，說明在此次分離的耐藥菌株中沒有質(zhì)粒介導的耐藥產(chǎn)生。

3 討論

許多試驗結(jié)果表明，銅綠假單胞菌臨床分離株對喹諾酮類藥物的耐藥性與喹諾酮類藥物在臨床上應用的廣泛性一致，許多藥物呈高水平耐藥。此外，成都地區(qū)的銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物的耐藥情況與國內(nèi)其他地區(qū)有相似性。細菌對抗菌藥物的耐藥存在兩種重要的現(xiàn)象，即交叉耐藥和多重耐藥。本研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌對5種喹諾酮藥物表現(xiàn)出交叉耐藥，而且均表現(xiàn)出高水平耐藥。這也是銅綠假單胞菌感染難治的重要原因之一。

許多研究表明，銅綠假單胞菌細胞膜上的多種蛋白具有將抗菌藥物主動外排的作用，即細胞膜上存在主動外排系統(tǒng)。CCCP是最典型的質(zhì)子泵抑制劑，可通過抑制主動外排耐藥系統(tǒng)能量來源的質(zhì)子濃度梯度，從而破壞其主動外排作用，表現(xiàn)為藥物在細菌中的蓄積顯著增加。本研究結(jié)果證實，銅綠假單胞菌對5種喹諾酮類藥物耐藥有主動外排作用，而且主動外排作用具有一定的特異性和交叉性；對氧氟沙星耐藥的13號和25號菌株細胞內(nèi)藥物蓄積量在加入CCCP后有所增加，說明了臨床分離銅綠假單胞菌主動外排藥物的存在。因此，尋找能夠抑制細菌主動外排作用的藥物，對于克服細菌耐藥具有重要意義。

主動外排系統(tǒng)中，MexAB-OprM外排系統(tǒng)最具有臨床意義。OprM蛋白在MexAB-OprM外排系統(tǒng)中起著重要的作用，oprM基因過度表達，導致了銅綠假單胞菌對多種抗生素耐藥。本研究顯示，oprM基因在耐藥菌中過度表達，初步說明耐藥與oprM基因高水平表達具有相關(guān)性。MexR蛋白是MexAB-OprM外排系統(tǒng)生理條件下轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白，mexR基因的突變導致MexAB-OprM去阻遏，從而使細菌獲得耐藥性。對mexR基因的研究結(jié)果表明，存在堿基發(fā)生突變的情況，所翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去阻遏蛋白的功能，進而導致MexAB-OprM外排系統(tǒng)的過量表達，產(chǎn)生耐藥[5-6]。13號菌株沒有出現(xiàn)堿基發(fā)生缺失和突變的情況，說明MexAB-OprM外排系統(tǒng)的調(diào)控還有其他因素存在。

近年來許多學者發(fā)現(xiàn)，存在質(zhì)粒介導的耐藥機制，其中qnr質(zhì)粒編碼的qnr蛋白能阻斷喹諾酮類藥物對DNA回旋酶的抑制作用，從而引起低水平耐藥[7]。本研究中，沒有發(fā)現(xiàn)qnr質(zhì)粒介導的耐藥，這可能與檢測的菌株過少有一定的關(guān)系。

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