HLA-DRB1基因多態性與新疆維吾爾族人群結核病易感性的相關性研究*

王 喜,賀 鵬,劉玉彩,吳 芳,王 萍,章 樂,張萬江

結核病目前仍然是威脅人類三大感染性疾病之一,全球約1/3人口感染結核分枝桿菌。但是,在感染人群中僅1/10發病,提示個體差異可能與結核病易感性相關。現代免疫學證實,T細胞受體-抗原肽-主要組織相容性復合體構成的三分子復合體是特異性細胞免疫應答的分子基礎。HLA-Ⅱ類基因在抗原提呈和免疫應答中起著重要作用,其某些變異的等位基因可能使人體對某些疾病產生易感性〔1〕。國外已有不少學者對此進行了研究并取得了令人振奮的成果。我國也有中國北方漢族部分人群肺結核發病與 HLA-DRB1*15等位基因密切相關〔2〕,中國南方漢族部分人群肺結核發病與DR16等位基因密切相關的報道〔3〕。但有關HLA-DRB1等位基因與中國新疆維吾爾族人群結核病易感性的相關性研究未見報道。由于HLA等位基因在不同種族、不同地域的人群中有很大的差異,因此對不同種族、不同地域的結核病患者與HLA基因的相關性進行研究其意義將更加重大。我們采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物(polymerase chain reactionsequence specific primers,PCR-SSP)技術對226例新疆維吾爾族肺結核病患者和231例新疆維吾爾族健康對照者進行HLA-DRB1基因分型并比較其基因頻率(GF),探討HLA-DRB1基因多態性與新疆維吾爾族人群結核病易感性的關聯。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 肺結核病例組 新疆阿克蘇地區長期生活的維吾爾族結核病患者226例,其中男115例、女111例,年齡18～68歲。病例按照國家制定的肺結核診斷標準〔4〕診斷。

1.1.2 健康對照組 新疆阿克蘇地區長期生活的維吾爾族正常人231名,其中男118名、女113名,年齡20～70歲。

1.2 主要試劑及儀器 Tap DNA聚合酶(北京天根生物公司)、蛋白酶 K(德國Merck公司)、引物(北京三博遠志生物公司)、dNTP(北京天根生物公司)。T-GRADIENT PCR儀(Bio-RAD,USA),微量凝膠電泳系統(Bio-RAD,USA),紫外光分析系統(Bio-RAD,USA)。

1.3 試驗方法

1.3.1 外周血白細胞基因組DNA提取 取抗凝血加入2倍體積的淋巴細胞分離液,用水平離心機以1 500 r/min離心 30min收集白細胞,之后用PBS洗滌2遍。用酚氯仿法提取白細胞中的 DNA〔5〕。

1.3.2 DNA純度測定 取DNA樣本少許,用紫外分光光度計測定其在波長230、260、280nm處的吸光度值。若OD260/OD280＞1.7,OD260/OD230＞2.0,則DNA純度合格,否則重新提取。

1.3.3 引物的設計與合成 序列特異性引物(SSP)共13對 ,參照Olerup 等〔6〕針對DRB1等位基因第二外顯子多態性設計的特異性堿基序列。陽性內對照選取人生長激素基因,上游引物序列為:5'-GCCT TCCCAACCAT TCCCTTA-3',下游引物序列為:5'-TCACGGATT TCTGT TGTGT TTC-3',擴增片段長度為429bp。上述引物均由北京三博遠志生物公司合成。所擴增的13個DRB1等位基因名稱、擴增片段長度及其各引物序列見表1。

表1 HLA-DRB1基因PCR-SSP分型采用的各引物序列和產物大小Table 1 Primer sequences and sizes of PCR products used for HLA-DRB1 genotyping by PCR-SSP

1.3.4 特異性PCR擴增 每一個樣本DRB1位點同時進行13個獨立的PCR反應,每一個反應管中均含有確定相應位點等位基因型別的特異性引物和內對照引物。PCR反應體系:10×PCR buffer 3μL,2.5mmol/L dNT P 4μL,10pmol/μL 的特異性引物各0.8μL,10pmol/μL的內對照引物各0.3μL,50-100ng/μL 基因組 DNA 3μL,2.5U/μL Tap DNA 聚合酶0.8μL,用去離子水補足至25μL。擴增條件為:94℃預變性5min;94℃變性30s,60℃退火1min,72℃延伸 1min,共 30個循環;72℃延伸5min。

1.3.5 PCR擴增結果檢測 取擴增產物5μL與上樣緩沖液 1μL混勻,用 2%的瓊脂糖凝膠電泳,100V,25min。電泳結束后于紫外成像儀上觀察結果并記錄。

1.3.6 DNA測序 對每一等位基因隨機抽取10%PCR擴增產物送上海生工生物技術有限公司進行精確核酸序列檢測。

1.3.7 統計學分析 兩組各等位基因頻率的計算采用公式GF=1-(1-f)1/2,f為人群中某等位基因陽性個體的百分率。病例組與對照組等位基因分布的差異采用 χ2檢驗或Fisher's精確檢驗。用校正P值(Pcorrect,Pc值)以Pc＜0.05作為有顯著性差異的判斷標準,Pc值等于P值乘以實驗研究中所檢測到的等位基因個數。疾病與H LA-DRB1等位基因的相關性通過計算比值比 OR(odds ratio)和95%可信區間(95%confidence intervals,95%CI)來表示;統計分析由SPSS13.0統計分析軟件處理。

2 結 果

2.1 HLA-DRB1基因特異性擴增結果 每個樣本DRB1位點同時進行13個獨立的PCR反應,每次PCR反應的結果判斷必須在有內對照引物擴增條帶出現的前提下進行。個體的H LA-DRB1基因型別直接由相應特異性引物擴增條帶的出現確定。圖1為一例樣本PCR-SSP擴增產物電泳圖譜。

圖1 HLA-DRB1*04/07雜合體PCR-SSP擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR-SSP products of HLA-DRB1*04/07 heterozygote

2.2 測序結果 對每一等位基因隨機抽取10%PCR擴增產物進行測序,測序結果利用NCBI中的BLAST軟件分析后,與參考序列同源性高達99%。

2.3 病例組和對照組 HLA-DRB1基因頻率檢測結果 PCR-SSP法擴增HLA-DRB1各等位基因在226例PTB病例組及231例正常對照組中的分布情況,詳見表2。在所檢測的13對等位基因中我們發現:肺結核病例組中DRB1*11等位基因頻率顯著高于健康對照組,兩組的GF值分別為4.53%和1.09%,差異有統計學意義(χ2=9.872,OR=4.388,Pc=0.026＜0.05)。肺結核病例組中HLADRB1*04基因頻率顯著高于健康對照組,兩組的GF分別為12.77%和8.36%,但P值經過校正后Pc＞0.05,差異無統計學意義。

表2 肺結核病例組與對照組的HLA-DRB1等位基因頻率比較Table 2 Comparision of the HLA-DRB1 alleles frequence of PTB patients and controls

3 討 論

隨著基因組流行病學的發展,宿主易感基因在結核病發生與發展中的作用日益受到人們的重視,越來越多的結核病候選易感基因被確認,通過關聯分析研究這些基因在結核病發生發展中的作用已成為當前該領域一個重要的研究方向。

H LA復合體遺傳區位于人類6號染色體短臂上,全長約4 000 kb含有約 4×106個堿基,約占人類基因組堿基數的0.1%。H LA復合體是迄今己知人體最復雜的遺傳多態性和免疫多態性基因體系〔7〕現已發現有70余種疾病與 HLA基因多態性相關聯,其中大多數自身免疫性疾病與HLA-II類基因相關。國內外許多學者研究發現結核病易感基因HLA-DRB1基因的多態性與結核病發生發展有關聯,而且對于不同的人種和民族,研究結果不完全相同,有的結果還完全相反,因此推測結核病易感基因HLA-DRB1基因的多態性與結核病易感性有關聯,而且可能存在明顯的種族差異性。

有關H LA-DRB1基因與肺結核病的關聯國內外都有相關報道:伊朗人肺結核病與DRB1*07密切相關〔8〕,DRB1*0803與朝鮮人肺結核耐藥患者密切相關〔9〕,HLA-DRB1*13,*14等位基因與圖瓦地區肺結核病密切相關〔10〕,南非Venda地區肺結核病與DRB1*1302密切相關,同時發現單倍型DRB1*1101-1121存在連鎖不平衡〔11〕,波蘭北部人群結核病與 DRB1*14、DRB1*16 相關〔12〕,墨西哥東北部肺結核病人與H LA-DR11(5),-DR16(2)緊密相關,DR11(5)-DQ7(3),DR14(6)-DQS(1),DR16(2)-DQ7(3)單倍型在病例組中頻率較高;HLA-DR17(3),DQ8(3)等位基因及DR17(3)-DQ2,DR4-DQ8(3)單倍型在對照組中頻率較高〔13〕。

我們的研究結果顯示:新疆維吾爾族人群肺結核病例組中HLA-DRB1*11,等位基因頻率顯著高于健康對照組,提示新疆維吾爾族人群肺結核的發病可能與H LA-DRB1*11等位基因相關聯。這與我國先后報道北方漢族部分人群肺結核病易患性與DRB1*15密切相關,南方漢族部分人群肺結核病的易感基因可能為DR16不相一致。這進一步證實了不同地域、不同種族的人群對結核分枝桿菌的易感性不同。

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