我國家禽戊型肝炎病毒感染情況的調查*

耿彥生,張 碩,趙晨燕,汪葆玥,田克恭,王佑春

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要經腸道傳播,既可散發也可暴發流行,我國是戊型肝炎的流行區。目前研究認為戊型肝炎為人畜共患疾病,豬是HEV的重要儲存宿主和傳染源〔1〕。除了豬之外,其他許多動物體內也檢測到了HEV抗體,表明這些動物也存在HEV的感染〔2〕。最近美國學者從患肝脾腫大的雞體內分離到一種新病毒,命名為禽戊型肝炎病毒(禽HEV),隨后的研究發現健康雞的體內也存在禽HEV感染〔3〕。為了解我國家禽戊型肝炎病毒的感染情況,我們分別在我國南方和北方15省、市(或自治區)采集了雞和鴨的血清,進行了HEV抗原、抗體以及HEV RNA的檢測,現報告如下。

1 材料和方法

1.1 血清樣本雞、鴨血清樣本由中國動物疫病預防控制中心于2008年10-11月份采集于我國的15個省、市、自治區,每個省份選取1-2個養殖場。血清采集后低溫保存和運輸,到實驗室后-20℃凍存。

1.2 血清HEV抗體和抗原的檢測 應用北京萬泰藥業股份有限公司生產的戊型肝炎病毒抗原診斷試劑盒和戊型肝炎病毒總抗體(HEV-Ab)診斷試劑盒進行HEV抗原、抗體的檢測。實驗操作和結果判斷按照試劑盒說明書進行。

1.3 HEV RNA的檢測 根據血清學檢測結果,對抗體陽性率較高的陜西、西藏和海南3個省份的所有血清樣本以及其它HEV抗原陽性樣本進行HEV核酸檢測。應用北京金豪制藥股份有限公司生產的戊型肝炎病毒 RNA檢測試劑盒,對血清樣本進行RNA提取。應用能夠擴增HEV 1-4型的ORF2區域引物〔4〕和能夠擴增ORF1解旋酶區域的保守的通用禽 HEV引物〔3〕,通過套式RT-PCR進行HEV RNA和禽HEV RNA檢測。

前者外引物為:

內引物為:

后者的外引物為:

內引物為:

RT-PCR的反應條件與文獻描述相同〔3-4〕。

2 結 果

2.1 雞血清HEV抗原、抗體檢測結果 本研究共檢測來自15個省、市、自治區的雞血清1 507份,其中54份標本為HEV抗體陽性,平均陽性率為3.58%(表1)。山西、山東和四川的標本中未檢出HEV抗體,其他12個省份HEV抗體陽性檢出率在1.02%至9.09%之間,不同省份之間有統計學差異;將北方省份,即天津、山西、內蒙古、山東、陜西、寧夏、新疆、西藏8省、市的平均陽性率3.28%(34/1 038)與南方省份四川、江蘇、上海、廣東、福建、江西、海南的平均陽性率4.26%(20/469)進行比較,并沒有顯著性差異(χ2=0.91,0.25＜P＜0.05)。HEV抗體陽性標本S/CO值最高為18.96,54個陽性樣本的平均值為 4.51±5.84。15個省、市的1 507份雞血清中,8個省市的26份血清HEV抗原陽性,總陽性率為1.73%(26/1 507),26份抗原陽性血清的平均S/CO值為2.44±1.82。8個省市的抗原陽性率在0.24%至11.11%之間,不同省份的陽性率有統計學差異;將南方7省市的平均抗原陽性率3.41%(16/469)與北方8省市的抗原平均陽性率0.96%(10/1038)進行比較,南方的陽性率高于北方(χ2=11.4,P＜0.05)。

2.2 鴨血清抗原、抗體檢測結果 140份鴨血清取自我國南方五個省份(或市),其中10份血清為HEV抗體陽性,陽性率為7.14%(10/140),陽性樣品的平均S/CO值為3.07±2.14(表2)。福建和上海的血清中分別有1份為HEV抗原陽性,平均陽性率為1.43%(2/140)。

將鴨血清的HEV抗體陽性率7.14%(10/140)與同樣5省份雞血清的平均抗體陽性率5.64%(19/337)進行比較,沒有顯著性差異(χ2=1.68,0.1＜P＜0.25);兩者的平均S/CO值相比較也沒有統計學差異。

2.3 RT-PCR檢測結果 應用Nested PCR,分別以1-4型HEV基因組為基礎設計的ORF2區域的引物,以及禽HEV基因組為基礎設計的ORF1區域的引物對HEV抗體陽性率較高的陜西和海南的全部雞血清樣本以及其他HEV抗原陽性的雞血清和鴨血清樣本進行HEV RNA檢測,檢測結果均為陰性。

3 討 論

根據基因組變異性,人和其它哺乳動物HEV主要分為四個基因型,即基因1型、2型、3型和4型。由于HEV ORF2區域氨基酸序列保守,不同基因型存在血清學交叉反應,目前認為HEV血清型只有一個〔1〕。禽HEV被歸為戊型肝炎病毒屬,暫定為基因5型〔2〕。研究發現基因重組禽HEV的ORF2蛋白既含有其獨有的抗原表位,同時也含有與人、豬 HEV共有的抗原表位〔5-6〕。禽 HEV和人HEV(基因1型)ORF2區域在氨基酸水平具有約56%～62%同源性,ORF2蛋白抗原及相應單克隆或多克隆抗體存在交叉反應〔2-3〕。因此,應用哺乳動物HEV ORF2蛋白作為已知抗原制備的EIA試劑盒,既可檢測1-4型HEV相應抗體也可以檢測禽HEV抗體,但檢測后者的靈敏度可能比較低。本研究中所用EIA試劑盒采用雙抗原夾心法檢測抗體,即通過預先包被的基因1型HEV ORF2重組蛋白抗原吸附待檢血清中的HEV抗體,辣根過氧化物酶(HRP)標記的ORF2蛋白抗原再與已吸附的抗體結合,所以也能夠檢測禽HEV的相應抗體,并且檢測的HEV抗體為血清中的總抗體,即包括HEV IgM 抗體和IgG抗體,提高了檢測靈敏度〔7〕。

我國在多種家畜中檢測到了HEV抗體,并且已經證實自豬體內分離到的HEV與HEV散發病例中分離到的人 HEV有高度同源性,有些散發HEV病例的發生可能與豬HEV的傳播有關〔4,7-8〕。然而,雖然也有關于家禽HEV的血清流行病學的研究報告,但可能由于研究方法不一致,或者樣本量比較小,禽類是否有HEV感染并沒有得出明確的結論。本次研究中,雞和鴨血清都有 HEV抗體陽性樣本檢出,雞、鴨總陽性率分別為3.58%和7.14%。并且我們發現有些血清樣本HEV抗體滴度很高,雞血清S/CO值最高可達18.96,與豬血清的最高值接近〔7〕。血清中HEV抗原的出現是表明HEV感染的一個更直接指標,本研究應用HEV EIA抗原檢測試劑盒進行檢測,發現雞和鴨血清中都有抗原陽性樣本,陽性率分別為 1.73%和1.43%。這些結果說明我國家禽中確實存在HEV或者禽HEV的流行。

表1 雞血清HEV抗原、抗體檢測結果Table 1 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in chicken sera

表2 鴨血清HEV抗原、抗體檢測結果Table 2 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in duck sera

在15個省份的雞和5個省份的鴨血清樣本中,分別有12個省份的雞和 4個省份的鴨檢測到了HEV抗體,不同省份之間雞和鴨HEV抗體陽性率都有統計學差異。由于每個省份只選取了某一地區的1-2個養殖場采集標本,各省份的HEV抗體陽性率不一定能夠表明該省份的真實流行情況,但可以說明不同養殖場或不同雞群或鴨群HEV抗體陽性率存在差異。這與豬HEV感染情況的結果一致,養殖場的環境、衛生條件等影響豬HEV抗體陽性率〔9〕。為了解氣候及地理因素是否影響禽類HEV的流行,我們將北方8省份雞抗體平均陽性率與南方7省份的雞抗體平均陽性率進行比較,結果未發現明顯差異;但南方省份雞血清的抗原陽性率高于北方省份,除西藏外,多數北方省份的雞血清樣本沒有檢出HEV抗原或抗原檢出率很低。HEV感染通常為急性,HEV抗原陽性表明家禽正處于急性感染期。本次研究的血清標本采自10-11月份,此時北方逐漸變得寒冷、干燥,而南方依然炎熱、潮濕。此結果表明,HEV在家禽中的傳播可能會受地理、氣候的影響,但仍需進一步研究確證。來自南方五省份的鴨血清的HEV抗體陽性率與同樣五省份的雞血清陽性率進行比較,沒有明顯差異。

哺乳動物HEV是否能夠跨種屬感染禽類,目前還不清楚。但最近我國學者報告,在一個相對封閉的野生動物園的鳥類糞便中分離到了兩株4型HEV〔10〕。本次研究所應用的檢測HEV的PCR引物為HEV ORF2簡并引物,高度保守,除人和豬HEV外,最近應用此引物在兔血清中檢測到了HEV RNA〔11〕,但在 HEV 抗原陽性26份雞血清和2份鴨血清中,以及抗體陽性率較高省份的其它雞、鴨血清中,沒有檢測到哺乳動物 HEV RNA。禽HEV感染在美國等國家雞群中普遍存在〔2〕,但到目前為止我國還沒有分離到禽HEV。本次試驗,我們應用美國等國家所采用的禽HEV核苷酸序列高度保守的ORF1解旋酶區域引物對抗原陽性標本和抗體陽性率較高的省份血清標本進行RT-PCR,也沒有得到陽性結果。其主要原因可能是由于HEV基因組存在地理性差異〔1〕,流行于美國的禽HEV和流行于我國的禽HEV核苷酸序列差異比較大,以其為基礎設計的引物與我國禽HEV吻合性差,致使RT-PCR的檢測靈敏度降低。那么在我國雞群中流行的HEV究竟是哺乳動物HEV(1-4型)跨種感染,或者是禽HEV在雞群中流行,目前仍不清楚,還需要進一步研究。

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