棘球蚴原頭節細胞凋亡的觀察*

康金鳳,胡漢華,陳 蓉,武貴臻,杜同心,丁智慧,賀曉燕

棘球蚴寄生于人體所引起的疾病稱棘球蚴病或包蟲病。包蟲病是嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。包蟲病的治療,目前仍以手術治療為主。尋找有效的非手術的治療方法是我們的研究目標。細胞凋亡是細胞死亡的一種形式,是由外界因素觸發細胞內部死亡機制,最終導致的細胞自身毀滅,在細胞毀滅的過程中,一般不伴有炎癥反應〔1〕,是一種理想的殺蟲方式。有關寄生蟲學領域的細胞調亡,相關學者已在醫學原蟲、醫學蠕蟲方面做了一些研究〔2〕,但是目前尚未見棘球蚴內原頭節自身產生細胞凋亡的報道。原頭節是棘球蚴的重要組成部分,并且在完成該蟲生活史中起著不可替代的作用;原頭節還在組織結構上與棘球蚴有許多相同或相似之處〔3-4〕。本文觀察了棘球蚴內原頭節自身是否存在細胞凋亡現象和探索了原頭節發生細胞凋亡的可能機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原頭節 采自新疆烏魯木齊屠宰場當日宰殺的新疆綿羊的肝臟或肺臟的細粒棘球蚴。將長有棘球蚴的臟器表面消毒后,分離、暴露出棘球蚴。用無菌注射器盡量吸出棘球蚴中囊液和游離的原頭節。手術摘除棘球蚴囊壁并在吸出的囊液中涮洗以收集殘留的原頭節和小育囊。備用。

1.1.2 試劑 兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(編號為BS-0169R)、兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(編號為 BS-0081R),美國ZYMED過氧化物酶標記鏈酶卵白素(SP)染色試劑盒,二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒,均購自北京博奧森生物公司。TUNEL(原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶標記)細胞凋亡原位檢測試劑盒為凱基生物科技發展有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 普通顯微鏡觀察 直接吸取采集出來的原頭節于載玻片,蓋上蓋玻片即可用不同倍數顯微鏡觀察。

1.2.2 免疫組化檢測 按文獻〔5〕方法制作原頭節組織切片。Caspase-1與caspase-3抗體濃度按1∶300稀釋。切片經高壓熱修復,其余均按試劑盒說明操作。DAB(二氨基聯苯胺)顯色,蘇木素復染。光學顯微鏡下觀察。caspase-1與caspase-3均以細胞漿(可包括細胞核)被染成棕黃色為陽性,無黃染者為陰性。另以PBS代替Ⅰ抗以排除假陽性。

1.2.3 T UNEL檢測 按試劑盒說明操作。原頭節用4%中性甲醛固定24～48 h后,先后用瓊脂糖和石蠟包埋原頭節,制作厚4 μ m的組織切片。經DAB顯色和蘇木素復染后,顯微鏡觀察。凋亡細胞的細胞核被T UNEL試劑染成棕黃色,正常細胞核不著色,正常細胞核可被蘇木素復染成藍色。

1.2.4 透射電鏡觀察 收集的原頭節用無菌生理鹽水洗滌1次,用4%戊二醛前固定24 h,再用1%鋨酸后固定、丙酮梯度脫水、Epon812環氧樹脂包埋后,用瑞典LKB-2188超薄切片機切成60nm厚,鉛鈾電子染色,日本JEOL1230透射電鏡觀察。

2 結 果

2.1 普通顯微鏡觀察 直接采集原頭節用顯微鏡觀察,可見一些原頭節結構清晰、完整,透光性良好,鈣顆粒清亮而明顯(圖1-箭頭所指);一些原頭節體積縮小,透光性降低,鈣顆粒變小或模糊不清,呈現枯萎征象(圖1-紅邊框箭頭所指)。

圖1 顯微鏡觀原頭節形態(×400)Fig.1 Morphology of protoscolex under microscope(×400)

2.2 免疫組化檢測 在收集的原頭節中,在同一張切片,甚至同一個育囊中,一些原頭節很少或幾乎無caspase-1、caspase-3表達(圖2、圖 3之 箭頭所指),一些原頭節則呈現極強的caspase-1、caspase-3表達(圖2、圖3之紅邊框箭頭所指)。而PBS代替Ⅰ抗者,所有原頭節都呈陰性反應,由此也排除了假陽性。

2.3 TUNEL檢測 用TUNEL法檢測發現,在上述caspase-1、caspase-3強表達的原頭節中同樣檢測到了大量調亡細胞(圖4之紅邊框箭頭所指)。檢測結果與caspase蛋白表達高度一致。

圖4 TUNEL檢測結果Fig.4 Result detected by TUNEL assay

2.4 透射電鏡觀察 在收集的原頭節中,正常原頭節體被合胞體帶向外長有排列整齊的微毛,微毛外側有較厚的PAS陽性物質,原頭節內部實質細胞呈圓形或橢圓形,細胞核大而明顯,核仁居中,核內染色質比較細膩,異染色質較少(圖5-A)。除正常原頭節之外,還見到了典型細胞凋亡形態改變的原頭節,表現為原頭節皮層微毛外PAS陽性物質消失,內部實質細胞胞質濃縮,并可見凋亡小體形成等細胞凋亡特征性改變(圖5-B、C)。

圖5 原頭節的透射電鏡觀察Fig.5 Observation on protoscolexby transmission electron microscope

3 討 論

凋亡細胞由于內源性核酸內切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口),暴露出大量3′羥基末端,如用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(TdT)將標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(-dUTP)進行缺口末端標記,則可原位特異地顯示出凋亡細胞,此即原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶標記技術——TUNEL法〔6〕。T UNEL法是一種將分子生物學與形態學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應細胞凋亡時典型的生物化學和形態學特征,不僅可用于從培養細胞和組織中分離的凋亡細胞的形態鑒定,亦可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片等。TUNEL法可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用〔7〕。本文用 T UNEL法對自然狀態原頭節進行檢測,發現有些原頭節存在不同程度的細胞凋亡。

迄今為止,透射電鏡仍然為最經典、可靠的判定細胞凋亡的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下可清晰地觀察到細胞凋亡的特征性的超微結構改變:如凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮;核染色質凝聚、邊緣化,呈新月形;胞質緊實,細胞器集中,胞膜起泡;凋亡晚期的細胞核裂解為碎塊,形成凋亡小體或可見凋亡小體被鄰近巨噬細胞吞噬的現象,等〔7〕。本文在自然狀態原頭節中見到有的原頭節呈現細胞質濃縮和凋亡小體形成等典型細胞凋亡改變,進一步證明棘球蚴原頭節自身存在細胞凋亡的現象。

Caspase-1、caspase-3是細胞凋亡在執行階段起中心作用的兩個半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。Caspase-1即白介素Ⅰ轉化酶(ICE),與線蟲自殺基因蛋白(CED-3)是同源物,其一級結構與CED-3有28%的同源性,可發揮與CED-3相似的作用。Caspase-3即相對分子質量32 000的半胱氨酸蛋白酶(CPP32),是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。未活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase-3)與 CED-3有 35%同源,是 caspase家族中與CED-3同源性最高的,不論結構同源性還是底物特異性,都與 CED-3相似〔8〕。所以有人認為它是CED-3在哺乳動物中的同源蛋白。另外,有報道認為檢測 caspase-3可用來區分細胞死亡的兩種形式——凋亡與漲亡,認為caspase-3在細胞凋亡中發揮核心作用,而在漲亡細胞中呈陰性表達〔9〕。關于棘球絳蟲細胞凋亡的具體機制目前尚不清楚。本文利用免疫組化技術,選用能與多種哺乳動物起交叉反應的caspase-1、caspase-3的多克隆抗體進行檢測,并用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照,以排除假陽性反應。結果在以上T UNEL法檢測陽性的自然狀態原頭節中檢測到caspase-1和caspase-3明顯表達。這不僅進一步證實細胞凋亡的存在,也提示原頭節中存在與ced-3類似的細胞凋亡基因。

作者已經在體外成功地用過氧化氫〔10〕和地塞米松聯合 AT P〔11〕誘導棘球蚴原頭節發生細胞凋亡,并在被誘導的原頭節中檢測到caspase-3活性明顯增高。本文又觀察到棘球蚴原頭節在宿主體內自身產生的細胞凋亡現象。進一步搞清原頭節產生細胞凋亡的機制,將為治療包蟲病新方法的探索提供理論依據。

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