男男性行為人群HIV-1基因序列測定和亞型分析

劉麗花 卜憲嶺 李衛紅 馬學志 周紅 王瑩瑩 劉曉松 黨靜 劉淑君

我國艾滋病傳播渠道正在轉變為以性傳播為主，男男性接觸者(men who have sex with men，MSM)HIV感染率已由2005年的0.4%上升到目前的4.9%，最高的地區甚至達到15%［1］，成為繼靜脈吸毒人群、有償獻血人群之后的第三大易感人群。為了解MSM人群中HIV-1的亞型分布特點，從分子水平闡明HIV-1流行線路和流行時間，指導對該人群的干預措施的設計和實施工作，對石家莊市2006至2008年報告的MSM感染者的HIV-1 env基因的C2-V3區進行了基因序列測定和分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 51例均經HIV抗體初篩與確認(WB)試驗證實為HIV-1抗體陽性的MSM。年齡18～50歲，平均年齡26歲;本市37例，本省其他市10例，外省4例。進行流行病學調查的同時采集0.15%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血5 ml，－20℃保存備用。

1.2 前病毒DNA的提取 取200 μl全血，使用QIACGEN公司QIAamp Blood DNA試劑盒提取前病毒DNA，－20℃保存備用。

1.3 基因片斷的擴增 用nest-PCR對HIV-1env外膜蛋白基因C2-V3區及鄰近基因區668 bp進行擴增。以ENV-D5、ENVD12為外側引物進行第1輪PCR反應，25 μl反應體系(10×buffer 2.5 μl，dNTP 濃度 200 μmol/L，Taq 酶 1.25 U，引物濃度0.5 μmol/L，核酸樣本 5 μl)，反應條件為 94℃ 5 min，54℃1 min 30 s，72℃ 2 min，3 個循環;94℃ 40 s，54℃ 1 min，72℃1 min，35個循環;72℃ 15 min。取 5 μl第 1 輪反應產物，以ENV7、ENV8為內側引物，50 μl反應體系，反應條件為 94℃5 min，50℃ 1 min 30 s，72℃ 2 min，3 個循環;94℃ 30 s，50℃40 s，72℃ 1 min，35個循環;72℃ 10 min進行第2輪 PCR反應。擴增引物見表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 目的片段的回收、純化及測序PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，選取陽性結果送往上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序，測序引物為ENV7/ENV8。

1.5 序列分析 根據測序結果，用美國Los Alamos國家實驗室HIV核酸序列庫中提供的基因分型工具BLAST程序結合系統樹分析進行基因型鑒定;用Clustlx軟件進行序列排列和比較，用MEGA3.1軟件的Neighbor-joining法進行系統樹分析，利用Distance程序計算基因距離。

2 結果

2.1 HIV-1亞型分布 env部分基因序列測序結果，通過美國Los Alamos國家實驗室HIV核酸序列庫中提供的基因分型工具BLAST程序結合系統樹分析進行基因型鑒定。分析結果顯示，51份樣品分屬B、CRF01-AE和CRF07-BC三種亞型。其中B 亞型32例(62.75%)，CRF01-AE 16例(31.37%)，CRF07-BC 3例(5.88%)。

2.2 系統進化樹和基因離散率分析 51份樣品的基因測序結果用Clustlx軟件進行序列排列和比較，用MEGA 3.1軟件的Neighbor-joining法進行系統樹分析，利用Distance程序計算基因距離。32份毒株與B亞型的標準株聚在一起，組內基因離散率為(13.3 ±0.8)%;與參考株 B.NL.0067、B.CN.xRL42、B.FR.83和B.US.98的平均基因離散率分別為(16.0±1.6)%、(16.5±1.7)%、(17.0±1.7)%和(19.4±2.0)%;進一步將毒株與各個標準株的基因距離進行兩兩比對，發現1株(編號107)與中國株 B.CN.xRL42的距離最近，5株(編號73、17、37、42、39)與法國株B.FR.83的距離最近，其余26株均與荷蘭株B.NL.0067的距離最近。16株與01-AE重組亞型代表株01-AE TH.90聚在一起，組內基因離散率為(7.1±0.7)%，與01-AE TH.90的平均基因離散率為(11.0±1.5)%。3株與BC重組亞型的代表株(07-BC/08-BC)聚在一起，通過計算基因距離，均與07-BC.CN.97的基因距離最近，組內基因離散率為(9.0±1.2)%，與07-BC.CN.97的平均基因離散率為(9.3±1.3)%。

3 討論

本次對石家莊市發現的51例MSM HIV-1感染者調查發現，存在B、CRF01-AE和CRF07-BC三種亞型，所占比例依次為62.75%、31.37%和5.88%。比北京2001年調查12例均為B亞型種類增加［2］，與深圳2006年調查18例［3］亞型種類一致，但各亞型所占比例有所不同，說明隨著男男性接觸人群艾滋病疫情的上升，該人群中HIV-1毒株呈現多元化趨勢，并且形成了不同的地區特點。B亞型是最早在美國同性戀人群中傳播的毒株，是目前歐洲和美洲的主要流行株［4］。本次調查發現在MSM B亞型流行株中，96.88%(31/32)與流行于歐洲的標準株(B.NL.0067和B.FR.83和B.US.98)有較近的親緣關系;組間變異最大，32個毒株間的基因離散率為(13.3±0.8)%，根據HIV-1env基因平均每年以0.5%～1.0%的速率變異計算［5，6］，可以認為B亞型毒株在MSM中流行的時間較長，約有14年。CRF01-AE毒株1989年最先在泰國發現，1994年在云南從泰國賣淫后回國的婦女中發現［7］，目前該毒株已成為東南亞地區的主要流行亞型，且主要通過性途徑傳播;16個CRF01-AE亞型毒株間的基因距離為(7.1±0.7)%，流行時間約為7年。CRF-BC是我國特有的重組亞型，主要在注射吸毒人群中流行，CRF07-BC主要流行于西北部及中部，CRF08-BC流行于廣東、廣西等地區［8，9］;本次和深圳［3］的調查顯示主要在注射吸毒人群中傳播的CRF07-BC已經擴散到不同地區的MSM人群中，并且基因分化較大，3例CRF07-BC毒株的基因離散率為(9.3±1.3)%，流行時間應約為9年。

本次調查發現，經流行病學調查有傳染關系的MSM的HIV-1基因序列呈現較高的同源性。B亞型中47號和54號的基因離散率為(1.7±0.5)%，顯示相互間的感染為1～2年;CRF01-AE中4號與46號基因離散率為(4.1±1.0)%，顯示相互感染4年左右;12號與21號的基因離散率為(2.4±0.8)%，相互感染2～3年。

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9 關琪，魏民，黃海龍，等.我國HIV-1 B/C重組病毒的gag-pol區基因序列特征分析.中華醫學雜志，2004，84:387-391.