兔視網膜挫傷后視網膜神經上皮水通道蛋白4的表達

付 群 師學偉 李 爽 王志玉 任芳芳

1 新鄉醫學院第三附屬醫院眼科（453000）

2 焦作市五官醫院（454000）

3 新鄉市中心醫院（453000）

4 福建省寧德市閩東醫院（355000）

視網膜挫傷是指眼部受到鈍性外力擊打所引起的視網膜損傷，其主要表現是急性視力損害和視網膜水腫、變性、出血、壞死，其發病機制尚未完全明了[1]。水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）在機體中介導各種類型細胞膜的水轉運[2]，在眼部也有廣泛分布[3]。本文通過對實驗性兔視網膜挫傷后不同時間段視網膜神經上皮AQP-4表達特點進行觀察，以期進一步了解視網膜挫傷的發病機制。現報道研究結果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器設備和試劑

Olympus光學顯微鏡；普通電冰箱（新飛電器集團）；恒溫培養箱（蘇州醫療儀器廠）；恒溫電熱烤箱（蘇州醫療儀器廠）；1/100000電子天平（上海光學儀器廠）；圖象分析系統（美國Media Cybernetics 公司）；AQP-4試劑盒（北京博奧森公司）；其他試劑均為國產分析純級；生理鹽水為醫用無菌制劑。

1.2 動物分組及模型制作

1.2.1 動物與分組

健康無眼疾成年大白兔42只（二級，新鄉醫學院動物中心提供），體質量2～2.5kg，雄雌兼用；飼養條件：開放系統，溫度18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度為40%～70%，換氣量12次/h，氨氣濃度≤14mg/m3，噪聲≤30dB，工作照度約200Ix，晝夜明暗交替時間12h/12h，普通飲水和全價飼料喂養。外眼及眼底檢查正常，選取右眼為致傷眼；隨機（隨機數字表法）分為挫傷后1h組、3h組、1d組、3d組、7d組、14d組和正常對照組共7組，各組均為6只。

1.2.2 視網膜挫傷模型制作

王志玉等[4]改良重擊法，致傷能量約為2.87 J（E=mgh）。所有造模由同一操作者序貫完成。

1.2.3 眼部傷情觀察

實驗家兔均在同一條件、不同時間點進行眼部傷情觀察，檢查眼球位置、結膜、角膜、前房、瞳孔、晶狀體、玻璃體和視網膜；眼底檢查是在用散瞳劑充分散瞳后用直接檢眼鏡對包括周邊部在內的眼底結構進行細致的檢查。眼部檢查由同一名高年資眼科醫師完成。

1.2.4 動物模型制作成功的判斷

傷眼直接對光反應遲鈍，瞳孔散大；檢眼鏡觀察眼底可見視網膜乳白色混濁、水腫范圍較大，同時伴有眼底出血，即認為模型制作成功，納入實驗。制模后結膜囊內涂紅霉素眼膏。

1.3 標本制備和視網膜AQP-4表達檢測

在規定時間點經由耳緣靜脈空氣栓塞處死各挫傷組兔子；于14d按上法處死正常對照組受試兔子；處死受試兔子后，迅速摘除受試眼球，置于冰臺上，修剪眼球表面的多余組織，0～4℃生理鹽水沖洗3次，沿角鞏膜緣后3～5mm處環形剪開眼球，剪除眼前節（角膜、虹膜、晶狀體等）和玻璃體，翻轉眼球壁使視網膜暴露于表面，用吸耳球沿視網膜周邊部吹打視網膜表面，這樣視網膜神經上皮層將脫離起來，此時可輕松剝取視網膜。然后按照AQP-4試劑盒說明書要求由專人嚴格操作；AQP-4表達以細胞膜呈不同程度的棕黃色為陽性，陰性結果無棕黃色表達。結果用圖象分析處理系統測量灰度值；每個標本任意選擇15個視野來檢測陽性表達細胞的灰度值：灰度值高表示AQP-4含量高，灰度值低表示AQP-4含量低。AQP-4灰度值以±s表示。

1.4 數據處理

采用SPSS13.0統計軟件包進行數據統計學處理；致傷組與對照組間均值的兩兩比較用t檢驗，致傷組各組間的差異分析用單因素方差分析（F檢驗），為雙側檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結 果

AQP-4在各組家兔視網膜神經上皮均有表達，陽性表達主要見于面對視網膜血管的神經膠質細胞突起，見圖1～圖7。

與正常對照組相比較，AQP-4的表達在視網膜挫傷后1h組（t=9.407，P＜0.01）、3h組（t=6.653，P＜0.01）、24h組（t=7.249，P＜0.01）、3d組（t=4.556，P＜0.01）、7d組（t=3.724，P＜0.01）和14d組（t=2.268，P＜0.05）均明顯升高；視網膜神經上皮AQP-4表達在視網膜挫傷后也呈現動態變化：傷后1h組即高于對照組（t=9.407，P＜0.01），3h組明顯升高，24h組AQP-4表達最強，3d組AQP-4表達已經明顯下降，挫傷后7d組表達下降更為明顯，14d組AQP-4表達仍高于正常對照組（t=2.268，P＜0.05）；各個挫傷組AQP-4表達也存在明顯差異（F=12.692，P＜0.05），見表1和圖8。

圖1 正常對照組 在神經節細胞層和內核層可見散在的陽性細胞（SABC，×200）

圖2 傷后1h 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數增多（SABC，×200）

圖3 傷后3h 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數進一步增多（SABC，×200）

圖4 傷后24h 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數明顯增多（SABC，×200）

3 討 論

圖5 傷后3d 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數減少（SABC，×200）

圖6 傷后7d 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數明顯減少（SABC，×200）

圖7 傷后14d 在神經節細胞層和內核層的陽性細胞數明顯減少，但是依然比正常組高（SABC，×200）

表1 視網膜神經上皮層AQP-4表達（灰度值）

圖8 視網膜挫傷后視網膜神經上皮層AQP-4表達動態變化

視網膜挫傷是導致眼外傷后視力喪失的主要原因之一，目前對視網膜挫傷后的臨床表現已經有了較充分的認識，但其發病機制并未完全明了，研究表明視網膜挫傷后會發生水腫，并且視網膜水腫是動態變化的[1]。

AQP-4在眼部有廣泛的分布，介導各種類型細胞膜的水轉運；AQP-4在視網膜上的表達最強，整個視網膜均可見 AQP-4陽性表達，特別是在外叢狀層、內核層、神經節細胞層AQP-4表達更明顯[3,5,6]。Hamann等[7]用免疫印跡、免疫電鏡證實 AQP-4主要表達于視網膜Müller細胞和星形膠質細胞，定量分析發現AQP-4在視網膜Müller細胞足突膜較非足突膜有高濃度的表達。眼組織AQP-4的調節機制尚不十分清楚，早先認為大多數AQP以固有的活性狀態存在于所分布的組織中，無需門控和調節，但后來很多實驗表明，在分子和基因水平還是存在著組織特異性調節，調節AQP的因素包括激素、神經遞質及細胞因子等[2,3,8-10]。本研究觀察到視網膜神經上皮層有AQP-4表達，并且AQP-4的表達在視網膜挫傷后呈現動態變化：在挫傷后1h AQP-4表達升高，挫傷后3h AQP-4表達升高明顯，挫傷后24h AQP-4表達最強，挫傷后3d AQP-4表達較前明顯下降，挫傷7d后AQP-4表達下降更為明顯，但3d組和7d組AQP-4表達仍高于正常對照組；挫傷14d后AQP-4表達也未完全恢復正常；而先前的研究提示視網膜挫傷后視網膜會發生水腫，并且視網膜水腫也是動態變化的[1]；因此，推測挫傷后視網膜神經上皮層AQP-4表達的動態變化和視網膜水腫的動態變化存在一定相關性。AQP-4在視網膜水腫中的變化是功能方面的作用，還是一種附帶現象，暫不能下定論。因此，AQP-4抑制劑的研發應用非常有意義。AQP-4的作用可能是雙方面的，它可能導致視網膜水腫的形成和發展，也可能起到保護作用。因此，這又為我們臨床治療提供了新的線索。AQP-4是水分子向細胞外轉移的直接通路或載體[11]，是膠質細胞和血管之間的水調節和運輸的重要結構基礎，以AQP-4作為治療的靶向，可能在防止視網膜水腫的發生發展具有一定的指導價值。目前對AQP-4與挫傷性視網膜水腫的研究還非常少，而臨床資料十分有限，這需要廣大學者共同去研究。

本研究僅僅是一個開端。在進行圖像分析時，由于是任意選擇15個視野來估計陽性表達細胞的灰度值，這樣也會造成很大的差別，對實驗結果也會有影響。因此，本研究還將進一步探討AQP-4在視網膜挫傷發病機制上的意義。

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