丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞色素-C的影響1)

王建華,劉瑞珍

腦缺血/再灌注損傷與程序性細胞死亡密切相關[1],近年來人們對凋亡的認識已經從細胞核的改變決定凋亡,發展為重視線粒體,因為它構成細胞存亡的控制中心,在線粒體依賴性細胞凋亡途徑中,細胞色素-C(Cyt-C)從線粒體內膜腔釋放到胞漿是凋亡過程的重要環節。研制細胞凋亡的有效抑制劑,可為改善缺血性腦血管患者的預后提供較好的幫助。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與儀器 健康雄性Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,由山西醫科大學生理實驗室提供,丁苯酞膠囊由石藥集團恩必普藥業有限公司提供(批號:08100111)。Cyt-C,TUNEL原位檢測試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;PM-10AD光學顯微鏡(Olympus optical Co.Ltd,JAPAN),BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)由山西醫科大學生理教研室提供。

1.2 分組與給藥 180只大鼠隨機分為假手術組(n=36),模型組(n=36),丁苯酞治療組(n=36),丁苯酞預防組(n=36),丁苯酞預防加治療組(n=36),每組再分為缺血再灌注6 h,12 h,24 h 3個亞組。丁苯酞給藥計量為80 mg/kg。假手術組與模型組于缺血2 h后腹腔注射同體積生理鹽水;丁苯酞治療組于缺血2 h后腹腔注射丁苯酞稀釋液;丁苯酞預防組采用手術前一周連續灌胃給藥,每日一次,手術當天不給藥;丁苯酞預防加治療組采用術前一周連續灌胃給藥,缺血2 h后腹腔注射給藥一次。

1.3 模型的制備 所有大鼠均按Zea Longa方法栓塞右側大腦中動脈,分別于缺血再灌注 6 h、12 h、24 h取材。期間在大鼠清醒時進行神經功能缺失體征評分,1分～3分為造模成功隨機補充。

1.4 檢測方法與步驟

1.4.1 HE染色觀察腦組織病理形態 大鼠麻醉,用內固定的方法取全腦。將腦組織從前向后切取2張厚3 μ m的冠狀切片置于載玻片上,后常規脫蠟,HE染色,封片,最后光鏡觀察。

1.4.2 免疫組化測Cyt-C 常規脫蠟,在3%H2O2中浸泡15 min,蒸餾水浸泡3 min后0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,高壓修復2 min,自然冷卻至30℃以下時0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,滴加一抗(按1:200稀釋)100 μ L,4℃冰箱過夜,室溫放置30 min后0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min×3次,滴加二抗 100 μ L,37 ℃烤箱置 20 min,室溫置 20 min,0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,生物素過氧化物酶(DAB)顯色,取蒸餾水 1 mL,加 DAB試劑盒中的 A,B,C試劑各一滴,混勻后加至切片。顯微鏡下觀察Cyt-C蛋白表達情況。采用BI-2000醫學圖像分析系統,測量Cyt-C染色陽性細胞的平均灰度值。

1.4.3 T UNEL法測凋亡細胞 根據試劑盒指導步驟完成實驗,顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。每張切片在10×25倍下隨機選取不重疊的5個視野,計數TUNEL陽性細胞數(胞核呈棕黃色顆粒)。

2 結 果

2.1 病理改變 假手術組缺血側腦組織形態結構正常,細胞密度大,無明顯水腫,模型組缺血側腦組織結構較疏松,間質水腫,部分細胞消失,有散在空腔形成,且出現不同程度的神經元變性、壞死,神經細胞數明顯減少,胞體縮小,胞核形態不規則,輪廓模糊。治療組、預防治療組腦組織形態結構基本正常,病理改變輕微,個別神經元變性、壞死。

2.2 免疫組化Cyt-C表達 假手術組呈弱陽性表達,模型組缺血再灌注后6 h Cyt-C強陽性表達,之后陽性表達逐漸減弱,表達區域主要集中在海馬區。丁苯酞治療組缺血再灌注后6 h、12 h、24 h Cyt-C表達較弱,與模型組比較有統計學意義(P＜0.01);預防組與模型組比較Cyt-C表達有差異;預防加治療組與治療組比較Cyt-C表達弱。詳見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后Cyt-C表達比較(±s)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后Cyt-C表達比較(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組 12 133.57±0.92 133.82±1.20 133.98±0.77模型組 12 102.96±0.961) 108.59±1.201) 116.89±0.691)治療組 12 126.03±1.443) 129.58±1.103) 131.07±1.093)預防組 12 104.53±1.132) 110.22±1.072) 118.11±1.242)預防加治療組 12 127.75±1.634) 131.00±0.584) 132.58±0.954)假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05;3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

2.3 TUNEL檢測結果 假手術組凋亡細胞少量表達;模型組各時間點凋亡細胞表達較多,主要集中在海馬區,與假手術組比較有統計學意義(P＜0.01),以缺血再灌注后6 h凋亡細胞最多;丁苯酞治療組凋亡細胞表達數較模型組少(P＜0.01);預防組與模型組比較凋亡細胞數有差異(P＜0.05);預防治療組與治療組比較凋亡細胞少量表達(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡數比較(±s)個

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡數比較(±s)個

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組 12 3.00±0.89 3.00±0.63 3.00±0.89模型組 12 36.17±3.551) 30.00±2.821) 28.83±3.551)治療組 12 22.17±3.193) 20.67±2.073) 19.17±2.643)預防組 12 33.00±2.612) 27.67±2.162) 25.83±3.062)預防加治療組 12 18.67±1.864) 17.83±1.724) 15.50±2.434)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

3 討 論

研究認為各種刺激誘導的細胞凋亡過程中,線粒體功能障礙導致Cyt-C從線粒體膜間隙釋放是普遍現象。Cyt-C是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體,它的缺失或功能障礙將會導致線粒體呼吸鏈出現功能異常,結果A TP缺乏,而導致細胞死亡[2]。目前多數人認為Cyt-C要通過兩條途徑引起細胞凋亡:一方面,凋亡過程中Cyt-C通過線粒體外膜釋放,在ATP/dATP的參與下,在胞質中與Apaf-1結合形成寡聚體,Apaf-1通過其氨基端和procaspase9的功能前區相互作用,導致caspase3激活,并進一步激活下游的caspases,從而將細胞凋亡的信息傳遞下去;另一方面是caspases非依賴途徑,Cyt-C缺乏時,ATP合成減少及不完全氧化造成的超氧陰離子(ROS)過度生成,它能使脂質發生過氧化、DNA氧化修飾、蛋白質氧化和酶的失活,這些損害最終導致細胞凋亡或壞死。

丁苯酞在基礎與臨床研究中已被證明可以阻斷急性缺血性腦損傷的多個病理環節,從而改善腦梗死的神經功能缺損癥狀。但其對缺血再灌注損傷的預防作用國內外尚未見相關研究,預防效果不得而知。然而近期國外有多篇關于對缺血再灌注損傷進行藥物或其他方法預防治療的文獻報道,且證實了對神經細胞的保護作用,并提出了幾種可能作用機制[3-5]。

本實驗中大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側腦組織結構較疏松,間質水腫,有散在空腔形成,出現不同程度的神經元變性、壞死,神經細胞數明顯減少。Cyt-C蛋白在缺血再灌注6 h組中表達最強,同時凋亡細胞計數最多,隨著缺血再灌注時間的延長,Cyt-C陽性表達逐漸減弱,凋亡細胞數減少,給予丁苯酞治療后3個時間點Cyt-C表達均較模型組減弱,凋亡細胞數明顯減少,組織病理改變顯著好轉,證明丁苯酞能夠有效抑制Cyt-C從線粒體的釋放,阻斷細胞凋亡信號的傳導,從而抑制細胞凋亡的發生,修復缺血后神經元的損傷。丁苯酞預防組與模型組、丁苯酞預防加治療組與丁苯酞治療組比較,Cyt-C表達減弱,凋亡細胞減少,證明丁苯酞預防也可能通過減少Cyt-C釋放起到神經保護作用,但其確切機制及Cyt-C與其他調控基因間的作用有待進一步研究。結合目前國內外對腦缺血再灌注損傷的預防研究,本實驗顯示抑制Cyt-C釋放的同時有一定的預防保護作用,但丁苯酞預防與治療的起始作用靶點、作用途徑、最終效果等是否一致仍無法證實,需要進一步研究。

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