香菇多糖對(duì)吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)的調(diào)控作用及其與原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞增殖關(guān)系的探討

伍 奕，曾 勇，梁松岳

（湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)于腫瘤的治療模式主要包括手術(shù)、放療、化療三種方式。研究表明，傳統(tǒng)的治療模式能夠治愈部分腫瘤患者，不是由于殺死了全部腫瘤細(xì)胞，而是由于當(dāng)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷明顯降低時(shí)，機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，清除了微小殘留病灶或明顯抑制了殘留腫瘤細(xì)胞的增殖。這說明機(jī)體免疫對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化有重要意義[1-3]。吲哚胺2-3雙加氧酶能夠催化色氨酸分子中的吲哚環(huán)氧化裂解，是犬尿酸分解代謝途徑的限速酶，體內(nèi)的吲哚胺2-3雙加氧酶在細(xì)菌和病毒、同種異體器官排斥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)展過程中表達(dá)增加，并可以通過改變微環(huán)境色氨酸及其代謝產(chǎn)物的局部濃度，達(dá)到抑制腫瘤抗原特異性克隆增生的免疫細(xì)胞數(shù)量以及誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的方式，幫助腫瘤細(xì)胞免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊[4-5]。目前，臨床上通過各種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來達(dá)到特異性或非特異性輔助治療腫瘤的治療模式已經(jīng)得到推廣。其中，以特異性較高的免疫藥物針對(duì)特異性的靶點(diǎn)開展治療目前還存在一定的技術(shù)上的壁壘。但是，通過應(yīng)用一些免疫調(diào)節(jié)劑并依靠非特異性地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，以達(dá)到治療腫瘤的模式已經(jīng)在臨床廣泛的推廣。臨床觀察發(fā)現(xiàn)晚期腫瘤病人大多伴有免疫功能紊亂，因此在手術(shù)切除腫瘤后使用免疫增強(qiáng)藥物，往往可以到達(dá)調(diào)整機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤的作用，減少腫瘤復(fù)發(fā)的作用[6-7]。其中，香菇多糖作為一種輔助性的免疫調(diào)節(jié)劑在臨床的使用較為廣泛，該藥物的使用對(duì)于提高抗腫瘤藥物的治療效果以及緩解患者癥狀方面均顯現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。香菇多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用的機(jī)制目前有著多種理論探討，該機(jī)制是否與機(jī)體內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)間存在某種聯(lián)系，目前還沒有相關(guān)的探討。介于以上背景，筆者設(shè)計(jì)本次觀察，旨在通過觀察香菇多糖對(duì)于乳腺癌細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)的影響的初步探討，力求探索香菇多糖輔助性治療腫瘤療效的機(jī)制，為解除機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，提高腫瘤的治療效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院住院手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織100例。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌89例、小葉癌7例、其他類型4例。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會(huì)制定的第六版分期標(biāo)準(zhǔn)，I期7例，IIA期25例，IIB期39例，IIIA期22例，IIIC期7例。所有病例均得到術(shù)后確切的病理學(xué)診斷。隨機(jī)分為兩組，香菇多糖組：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌41例，小葉癌3例，其他類型2例，其中，I期3例，IIA期12例，IIB期19例，IIIA期10例，IIIC期3例；空白對(duì)照組：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌48例，小葉癌4例，其他類型2例。其中，I期4例，IIA期13例，IIB期20例，IIIA期12例，IIIC期4例。

1.2 主要試劑

噻唑藍(lán)（MTT）為美國Sigma公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒購自Sigma公司；蛋白提取試劑盒購自Active Motif公司；兔抗人吲哚胺2-3雙加氧酶抗體購自Alexis公司、羊抗兔二抗購自Sigma公司。

1.3 MTT法測(cè)定香菇多糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響

在無菌條件下從剛切除的標(biāo)本上取癌組織1 g，經(jīng)過兩次生理鹽水漂洗，剪碎后放入0.25%胰蛋白酶消化液。細(xì)胞消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，制成單細(xì)胞懸液，分別加入96孔培養(yǎng)板中，5 000個(gè)細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)分香菇多糖組（分別加入香菇多糖10、20、40 uM）、空白對(duì)照組（不加藥物，只加細(xì)胞懸液）。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 uL，37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 Ul DMSO振蕩15 min后利用酶標(biāo)一檢測(cè)各孔在570 nm波長(zhǎng)除的吸光度值，然后計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝[1-(空白對(duì)照組A值-香菇多糖組A值)/空白對(duì)照組A值]×100%。

1.4 RT-PCR檢測(cè)香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因轉(zhuǎn)錄的影響

取單細(xì)胞懸液，以2×105/孔的濃度接種于6孔板種。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至約70%的覆蓋率時(shí)根據(jù)加香菇多糖情況分成4組：空白對(duì)照組、香菇多糖10、20、40 uM組，培養(yǎng)24 h。使用Trizol抽提總RNA，按照RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，從cDNA上擴(kuò)增目的基因。配置2.0%瓊脂糖凝膠，在120 V、25 min條件下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片的采集。

1.5 Western Blot法檢測(cè)香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)的影響

取單細(xì)胞懸液，以2×105/孔的濃度接種于6孔板種。根據(jù)加香菇多糖情況分成5組：空白對(duì)照組、香菇多糖10、20、40 uM組，培養(yǎng)24 h。總蛋白提取嚴(yán)格按照提取試劑盒說明書操作進(jìn)行。蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)膜法。先用5% 脫脂牛奶封閉后，再用TBST洗膜，分別加入各種一抗，4度過夜后，加入二抗室溫反應(yīng)1 h。洗脫后顯影。根據(jù)預(yù)期分子量大小區(qū)域出現(xiàn)的特異性條帶判斷蛋白表達(dá)量的高低。應(yīng)用Bio-Rad公司Quantity-one軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且該效應(yīng)隨藥物濃度的增加而增大。其中，10、20、40 uM香菇多糖對(duì)細(xì)胞的抑制率分別為（6.4±1.19）%，（10.3±1.67）%，（23.5±3.79）%。

2.2 香菇多糖處理后各組細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，香菇多糖處理細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因的表達(dá)，結(jié)果見圖1。藥物處理組細(xì)胞間吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性，其中，40 uM香菇多糖處理組細(xì)胞中目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平最低。藥物處理組與對(duì)照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見圖2。

2.3 香菇多糖處理后各組細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)的變化

圖1 香菇多糖處理2-3雙加氧酶基因表達(dá)

圖2 吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)灰度分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，香菇多糖作用腫瘤細(xì)胞后，吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見圖3，圖4。

圖3 香菇多糖處理2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)

表4 吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)灰度分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。它的發(fā)病常與遺傳有關(guān)，以及40～60歲之間、絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高。乳腺癌的治療與機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的關(guān)系是一個(gè)極具挑戰(zhàn)的領(lǐng)域。其中，關(guān)于乳腺癌患者自發(fā)性消退現(xiàn)象、許多乳腺癌病人能夠帶瘤生存、部分患者雖然在血液中檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞，但并未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等等現(xiàn)象，均提示我們?cè)擃惸[瘤的生長(zhǎng)與機(jī)體的免疫系統(tǒng)的防御能力關(guān)系密切。我們有充足的里有相信乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及藥物的治療效果與機(jī)體的免疫狀態(tài)有著直接的因果關(guān)系[8-10]。香菇多糖是一種生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，該藥是繼手術(shù)、放療和化療三大治療手段之后的第四種治療腫瘤的辦法，它通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫防御反應(yīng)或改變機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生機(jī)體或細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效果，發(fā)揮間接的抗腫瘤作用。長(zhǎng)期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)該藥物具有副作用輕微、對(duì)正常細(xì)胞無殺傷作用的特點(diǎn)。

近年來大量的研究表明，吲哚胺2-3雙加氧酶在腫瘤的免疫微環(huán)境以及腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用。多種組織的原代腫瘤細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞株均高表達(dá)吲哚胺2-3雙加氧酶。目前的研究明確，高表達(dá)的吲哚胺2-3雙加氧酶可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸饑餓狀態(tài)，使得機(jī)體的免疫細(xì)胞合成停滯于G1期，導(dǎo)致增殖受到抑制。另外，吲哚胺2-3雙加氧酶可以通過誘導(dǎo)色氨酸代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性作用，發(fā)揮對(duì)免疫細(xì)胞的直接溶解作用[11]。

為了明確香菇多糖對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的治療作用以及該作用對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)影響，作者設(shè)計(jì)了本次觀察。香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響實(shí)驗(yàn)表明，它能夠明顯的降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮明確的抗腫瘤作用，并且這種作用的強(qiáng)度與藥物劑量呈現(xiàn)相關(guān)性。介于吲哚胺2-3加氧酶對(duì)于腫瘤微環(huán)境中免疫體系的作用，以及香菇多糖作為一種免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的治療角色。作者還觀察了香菇多糖對(duì)于腫瘤細(xì)胞吲哚胺2-3雙加氧酶的基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，香菇多糖處理細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因的表達(dá)。香菇多糖組細(xì)胞間吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性。同時(shí)，這種基因水平的抑制作用可以在蛋白水平得到驗(yàn)證。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，香菇多糖作用腫瘤細(xì)胞后，吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)趨勢(shì)。

因此，香菇多糖對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的抑制增殖作用機(jī)制與抑制吲哚胺2-3雙加氧酶基因以及蛋白水平的表達(dá)有關(guān)，通過該機(jī)制使得機(jī)體的免疫微環(huán)境能夠保持較高的活性狀態(tài)，從而發(fā)揮監(jiān)視、治療腫瘤的功效。

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