亞低溫對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦組織Caspase-3的表達變化

趙旭晶,陰懷清,孫 玲,房清麗,武師潤,陰崇娟

圍生期缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischem ia brain damage,H IBD)是新生兒死亡和兒童致殘的主要原因之一,臨床上對該病尚缺乏有效的治療。最近研究表明,亞低溫對缺氧缺血性腦損傷具有抗損傷神經細胞凋亡作用,但其分子機制尚不明確。本實驗采用Rice法制作H IBD模型,用免疫組化法測定假手術組、H IBD組、亞低溫組Caspase-3的表達變化,旨在探討亞低溫抗損傷神經細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級,封閉群,7日齡W istar大鼠120只(由山西醫科大學實驗中心提供)雌雄不限,體重13 g±2 g。隨機分為3組,假手術組、H IBD組、亞低溫組。每組40只。每組根據處死時間不同又分為5個亞組:6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、72 h組,每亞組各8只。

1.2 模型制作 參照Rice等[1]的方法制備H IBD模型。對照組為假手術動物,只切開頸部皮膚分離出左頸總動脈不結扎,縫合皮膚。

1.3 儀器及亞低溫實施 半導體可調恒溫水浴箱(由上海理工大學制冷工程研究所研制),動物缺氧缺血結束后,立即將亞低溫組大鼠放入已接近半導體水浴箱水溫(25℃)的玻璃缸內,然后再將水溫設置到所需的溫度(30℃),30 m in左右水溫穩定在30℃,并維持至治療結束;常溫組大鼠立即放入已預熱至34℃的暖箱中至治療結束。以缺氧缺血后即刻作為零點,療程分別為6 h、12 h、24 h、48 h和72 h。

1.4 肛溫監測及喂養方法 用溫度探針(OM EGA450AET,美國)測定肛溫(RT)。每只動物每日進奶量[2](m L)=0.412×體重(g)-0.299。每隔2h～3h進奶1次,每次進奶量為0.3 m L～0.5 m L。

1.5 取材及檢測 標本留取,常規石蠟切片,二甲苯脫蠟,顯微鏡下觀察。各組均采用PV二步法檢測腦組織Caspase-3的表達,一抗為兔抗大鼠Caspase-3抗體(1∶200);免疫組化二步法檢測試劑盒(PV 6001)。以上試劑均購于北京博奧森生物技術有限公司。采用BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)進行圖像采集與分析。

2 結 果

2.1 腦組織外觀 H IBD組24 h左腦出現不同程度的出血和萎縮,48 h左腦萎縮較24 h明顯,72 h左腦不同程度的萎縮更明顯,并出現不同程度液化壞死。亞低溫治療24 h組雙側腦組織大小正常,無明顯萎縮;48 h組左腦出現輕微水腫。治療組各時間點均無液化壞死。

2.2 病理學觀察 病理學研究顯示,H IBD組24 h、48 h神經細胞壞死,胞體溶解,胞漿淡染,核固縮,72 h神經元壞死明顯,膠質細胞增生明顯,病灶中心可見核固縮和核碎裂;亞低溫治療組各時間點病理變化均較HIBD組輕,細胞排列尚規則,形態較正常,核居中,核仁尚清楚,僅見斑點狀神經元變性、壞死。

2.3 免疫組織化學觀察 Caspase-3相關抗原以胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。假手術組除細胞核染成藍色外,胞核和胞漿內無棕黃色反應物。H IBD組于H IBD后24 h及48 h陽性表達較多,72 h Caspase-3陽性細胞表達減少;亞低溫組各時間點Caspase-3陽性細胞表達減少,主要表達于大腦皮層神經元,膠質細胞和海馬錐體細胞,與H IBD組各時間點相比,表達均明顯減少(P＜0.01)。同一時間點假手術組,組間Caspase-3表達差異均無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時間點腦組織Caspase-3陽性細胞灰度值的變化(±s)

表1 3組大鼠不同時間點腦組織Caspase-3陽性細胞灰度值的變化(±s)

組別n 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h假手術組40 172.540±3.164 171.792±3.252 170.690±3.340 171.152±4.469 171.623±3.350 HIBD組40 158.583±3.0011)2)153.097±3.9971)2)144.140±4.5001)2)141.041±3.7091)2)150.986±3.9001)2)亞低溫組40 166.259±4.5621)160.849±4.8791)152.320±4.1731)152.056±3.8021)158.399±5.1221)與假手術組比較,1)P＜0.01;同一時間點H IBD組與亞低溫治療組比較,2)P＜0.01

3 討 論

自1995年Hill等[3]首次證明乳鼠腦缺氧缺血后存在細胞凋亡后,越來越多的證據表明凋亡在腦損傷病理生理過程中發揮重要著作用[4-7]。缺血性腦損傷所致的細胞凋亡可分3個階段:信號傳遞階段、中央調控階段和結構改變階段。其中中央調控階段根據起始激活Caspase的不同,凋亡活化途徑可分為3種:內源性途徑、外源性途徑、內質網途徑,以上3種途徑最后匯集到同一通路,即Caspase-9,8,12均切割激活Caspase-3,最終導致細胞的凋亡。故Caspase家族是細胞凋亡的關鍵元件,又稱為死亡蛋白,它的切割和激活中存在級聯放大效應和正反饋。其中激活Caspase-3之前又稱為凋亡的可逆階段,之后稱為凋亡的不可逆階段。本實驗采用免疫組化的方法檢測Caspase-3,以提示腦細胞的損害。

亞低溫是采用人工誘導的方法將體溫下降2℃～6℃,以達到治療的目的。近年大量的實驗研究表明,亞低溫對H IBD新生動物有明顯的神經保護作用,其作用機制主要有:降低腦組織氧耗量和無氧代謝;減少興奮性神經遞質過量釋放及其受體的激活;減少Ca2+內流,阻斷鈣對神經元的毒性作用;抑制氧自由基和一氧化氮大量生成減少腦水腫;抑制細胞活化;抗神經細胞凋亡等。因此亞低溫的作用是多途徑多靶點非特異的,優于其他任何藥物性治療。且具有簡便、快捷、安全等優點,被認為是新生兒H IBD臨床治療最具有潛力的措施之一。Shankaran等[8-9]開展的亞低溫動物實驗和新生兒研究總結,將全身體溫降至34.5℃(此時腦組織的溫度和食道內的溫度是一致的)對患兒及動物是安全的,未觀察到不良事件的發生。并且得出結論亞低溫是圍生期窒息所致中重度腦病最有希望的治療措施。美國心臟協會、美國兒科協會[10]在2005年新生兒復蘇指南中對幾個多中心研究的結果進行了綜述后指出,到目前為止還沒有報告中度低溫(即33℃～34.5℃)引起并發癥。虞人杰[11]認為亞低溫可望成為H IBD的有效治療方案。

本研究建立了新生大鼠H IBD模型,并給予亞低溫治療,探討了其對腦組織Caspase-3的影響。研究發現假手術組每個時間點可見到少量的凋亡細胞,Caspase-3有表達,但是表達很低,各時間點之間相比無統計學意義;Caspase-3陽性表達在H IBD模型組隨著時間延長表達逐漸增多,24 h及48 h較多,72 h腦組織Caspase-3陽性表達仍多于假手術組,這與先前的研究結果一致[12];亞低溫治療組各時間點Caspase-3陽性表達均明顯降低,與H IBD組各時間點相比有統計學意義(P＜0.01)。亞低溫可以降低H IBD后Caspase-3的表達,從而抑制凋亡,可以起到腦保護作用,對于治療新生兒H IBD及中樞神經系統損傷開辟了新道路,有廣闊的應用前景。對于亞低溫療法在臨床中的開展將作進一步的實驗觀察。

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