糖尿病小鼠大腦記憶功能及生化指標變化的實驗研究

李海 楊彩梅 玉瑩 覃美斌 楊猛 龍毅 梁溪樾 張樹球

533000 右江民族醫(yī)學院重金屬與氟毒物研究實驗室 (李海 楊彩梅 玉瑩 覃美斌 楊猛 龍毅 梁溪樾 張樹球)

糖尿病是一種因部分或完全胰島素缺失或細胞胰島素受體少或受體敏感性降低導致的糖代謝紊亂疾病[1]，是除了肥胖癥之外人類最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，也是被醫(yī)學界列為繼癌癥、心血管疾病之后的全球第三位疑難疾病。除發(fā)病機理復雜、發(fā)病率高、并發(fā)癥嚴重、尚無根治藥物外,發(fā)病率逐年增加的速度相當高。據(jù)預測,全球糖尿病患者將從2006年的2.46億增至2025年的3.8億[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者中，老年癡呆癥發(fā)生率高于其他人群[3]。本文以糖尿病小鼠為研究對象，通過y型水迷宮游水時間和錯誤測定小鼠的記憶功能，并與血糖和其他生化指標進行比較分析。現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 試劑與方法

1.1 試劑

四氧嘧啶, 鏈佐霉素，分析純，為Sigma產(chǎn)品。鄰甲苯胺、硫脲、硼酸、檸檬酸，均為國產(chǎn)分析純。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素測定試劑盒，購自四川成都邁克科技有限公司。

1.2 小白鼠

40只昆明種，雌雄隨機，健康，鼠齡60d。購自本校動物室。分籠喂養(yǎng)，每籠5只。

1.3 動物模型的建立[4]

四氧嘧啶模型，準確稱取四氧嘧啶，按200mg/kg計算，用蒸餾水溶解稀釋，給20只小鼠(已稱體重)作腹腔注射(一次注射)。鏈佐霉素模型，準確稱取鏈佐霉素，按每日50mg/Kg計算,用0.1mol/L檸檬酸溶液適量溶解稀釋，給12只小鼠作腹腔注射，每日1次，連續(xù)3d。另設(shè)正常對照組8只，用等體積稱生理鹽水，方法相同。測定72h、7d、2周、4周、8周后小鼠血糖含量。

1.4 測定方法

血糖測定，從小鼠尾巴取血20μL，用鄰甲苯胺微量法測定[5]。TG用GPO-PAP法測定；總膽固醇(TC)用COD-CE-PAP法測定；尿素用脲酶波氏法測定，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 記憶力測定

用y型水迷宮[6]，長1.5m，水深20cm。每只小鼠在水迷宮中訓練4d，每天游水3次，等其熟悉逃避地點上岸。休息1d后測定，記錄下水到達上岸的時間(s)和錯誤的次數(shù)，每次最長時間限定為40s，超過40s按40s計，并當作失敗。走進一個盲端算錯誤一次。每天測定3次，連續(xù)測定3d。

1.6 飼養(yǎng)

小鼠從本校動物室購買的標準混合固體顆粒飼料喂養(yǎng)。飲水為自來水，自由飲用，但每天記錄每只小鼠的飲水量。

1.7 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計學軟件進行方差分析，計量資料用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 四氧嘧啶造模結(jié)果

四氧嘧啶造模20只,死亡8只，死亡率占40.0%,血糖在11.1mmol/L以上7只,作為成功列入統(tǒng)計。鏈佐霉素造模12只，無死亡, 列入統(tǒng)計6只(50.0%)。

2.2 2種造模小鼠2周血糖測定結(jié)果

2種造模方法建立的糖尿病模型小鼠，其2周血糖含量均明顯高于正常對照組(P＜0.01)，而四氧嘧啶模型明顯高于鏈佐霉素模型。兩種模型組小鼠的飲水量也明顯高于正常組(P＜0.01)但四氧嘧啶模型組更高于鏈佐霉素模型組，與血糖幾乎有平行關(guān)系，見表1。

2.3 水迷宮測定結(jié)果

結(jié)果顯示，四氧嘧啶模型小鼠水迷宮到達時間(s)明顯長于正常組(P＜0.05)，錯誤次數(shù)和失敗次數(shù)也明顯多于正常組；鏈佐霉素模型小鼠到達時間雖稍長于正常組，但尚不夠明顯(P＞0.05)，錯誤次數(shù)模型組也多于正常組，但2組均未出現(xiàn)失敗,見表2。

2.4 2組血清生化指標測定結(jié)果

結(jié)果顯示，四氧嘧啶模型組TG、TC和尿素均明顯高于正常組(P＜0.05)；鏈佐霉素模型組TC明顯高于正常組(P＜0.05)，尿素含量兩組間無顯著性差異，TG相反，正常組明顯高于模型組(P＜0.05)。見表3。

3 討論

3.1 造模小鼠血糖明顯升高，飲水量也明顯增加

用四氧嘧啶造模的小鼠血糖高于鏈佐霉素造模的小鼠血糖，同時每天每小鼠飲水量前者也高于后者。2種造模方法血糖前者并非一定高于后者，可純與用藥劑量有關(guān)。但血糖的高低與飲水量的多少應是有一定的平行關(guān)系。用四氧嘧啶造模死亡率死亡率較高，用鏈佐霉素造模較低，但血糖也較低.

3.2 造模小鼠記憶力功能有明顯下降，與文獻報道相符合[3]

四氧嘧啶模型小鼠水迷宮到達時間明顯長于正常組，且失敗次數(shù)和錯誤次數(shù)明顯增多，說明其記憶功能較正常組差；鏈佐霉素模型組水迷宮到達時間也較長于正常組，但尚不明顯，錯誤次數(shù)也明顯多于正常組，但尚未有失敗，說明其記憶功能有一定的降低，但比四氧嘧啶組輕，這可能與其血糖較低于前者、病情較輕有關(guān)。國外調(diào)查顯示，中年糖尿病患者年老后患癡呆癥，尤其是早老性癡呆癥(阿爾茨海默氏癥，AD)的風險高于常人。調(diào)查顯示，隨著年齡的增長，癡呆癥的發(fā)病率逐漸增多，65歲以后總的癡呆癥發(fā)病為10%左右，大于85歲以上，升到35%～40%。而糖尿病患者中每年有12%～15%輕度認知損傷(MCl)輕度為阿爾茨海默病(AD)。患糖尿病15a以上認知障礙發(fā)病率為非糖尿病患者的1.4～3.2倍。研究證實，糖尿病可以導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝、神經(jīng)化學、形態(tài)學、電生理及神經(jīng)行為等多方面的改變，特別是與學習、記憶等認知功能有關(guān)的海馬區(qū)部位神經(jīng)細胞的損傷，而其作用機制更為復雜，其中之一如糖尿病患者醛糖還原酶(AR)活性增高，山梨醇通路激活引起山梨醇在體內(nèi)數(shù)信量的積聚。由此引起細胞內(nèi)高滲與水腫狀態(tài)，繼而直接損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能。現(xiàn)已證明，患者腎臟、神經(jīng)、視網(wǎng)膜、晶狀體內(nèi)山梨醇明顯升高。其他尚有糖尿病患者自由基產(chǎn)生過多和清除障礙，胰島素抵抗與高胰島素血癥等，均認為與記憶障礙發(fā)生有關(guān)。

表1 2種造模小鼠血糖含量測定結(jié)果

表2 2種模型小鼠水迷宮測定結(jié)果

表3 模型小鼠血清TG、TC和尿素含量比較

此外，血清甘油酯(TG)、總膽固醇(TC)和尿素，四氧嘧啶模型組明顯高于正常組，與文獻報道相一致[7]。血清尿素明顯增高，提示腎功能有一定的損害。鏈佐霉素模型組除血清總膽固醇明顯高于正常組外(P＜0.05)，尿素含量兩組間無明顯差異(P＞0.05)，除了本組病情較輕的原因外，還有待進一步探論。

[1] 查錫良.生物化學[M].7版,北京:人民衛(wèi)生出版社出版,2008:117-118.

[2] 黃勝炎.糖尿病治療藥研發(fā)新進展[J].上海醫(yī)藥,2009,30(8):376-379.

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[4] 覃雯,唐愛華.糖尿病實驗性動物模型研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(6):1511-1512.

[5] 安乙敏.生化檢驗學[M].成都:四川科學技術(shù)出版社出版,1990:68.

[6] 張樹球.黃秋艷,李朝敢,等.用Y型水迷宮測定鋅與海爾福口服液對鋁染毒所致小鼠記憶障礙的改善作用[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志,2006,23(5):546-548.

[7] 錢立榮.糖尿病與血脂異常[J].中國糖尿病雜志,2000,10(2):125.