大環內酯類藥物次抑菌濃度誘導沙眼衣原體耐藥的實驗研究

朱 輝，王惠平，江 勇，侯淑萍，劉原軍，劉全忠

（天津醫科大學總醫院皮膚科，天津 300052）

沙眼衣原體是一種嚴格的細胞內寄生的微生物，感染人體后可以引起尿道炎、宮頸炎、結膜炎、盆腔炎、性病性淋巴肉芽腫，可并發不孕、不育、異位妊娠等。大環內酯類藥物具有諸多抗菌活性，作用于細菌核糖體的50s亞單位，阻斷mRNA移位，從而抑制菌體蛋白質合成，是一類快速抑菌藥，臨床主要用于治療革蘭陽性球菌和革蘭陰性球菌及支原體和衣原體引起的呼吸道及泌尿生殖道感染[1]。但隨著大環內酯類抗生素在臨床的廣泛使用，沙眼衣原體耐藥率不斷上升，時有耐藥報道。為了解沙眼衣原體對大環內酯類的耐藥性及耐藥機制，本實驗對大環內酯類藥物的作用靶位23S rRNA及L4核糖體蛋白進行檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 13例E型沙眼衣原體臨床株和標準株E-UW-5/Cx由天津市性傳播疾病研究所提供并保存。

1.1.2 抗生素 紅霉素購自Sigma公司產品。阿奇霉素、交沙霉素購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試劑 生長培養液：10%MEM液90 ml，加入10 ml胎牛血清，0.125 ml慶大霉素注射液（終濃度為 50 mg/L）。

1.1.4 引物 L4核糖體蛋白、23S rRNA的引物序列由金思特科技（南京）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及沙眼衣原體接種 首先在6孔板內接種McCoy細胞，培養過夜，制備單層細胞。然后接種沙眼衣原體（4×10 IFU/ml)臨床株到單層細胞[每孔（1～2)×10 細胞]上，32 ℃、3000 r/mim 離心 1 h，在37℃、5%CO2孵箱中培養44～48 h后收集用于下一次傳代。

1.2.2 藥物敏感試驗

1.2.2.1 抗菌素工作液的配制：（1）根據藥物溶解性的不同[2]，紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素用無水乙醇溶解。用0.2 μm的無菌抽濾器濾過消毒，-20℃冰箱保存。（2）設置藥物濃度：抗菌藥濃度參照參考文獻[3]，并以文獻推薦濃度為中間濃度，最終設6個等比稀釋濃度 （mg/L）：①紅霉素：4、2、1、0.5、0.25、0.125（0.25～1）。②阿奇霉素：1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032（0.125～1）。③交沙霉素：0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01（0.02～0.16）。

1.2.2.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定：用MEM生長培養液在96孔聚乙烯板上將藥液倍比稀釋，96孔板的第1～10列用于測定最低抑菌濃度。每3列對應1種抗生素。每個實驗設A行陰性對照（加藥，但不接種沙眼衣原體）、H行陽性對照（接種沙眼衣原體，但不加藥）。每孔接種104IFU/ml沙眼衣原體0.1 ml孔板，放置于37℃、5%CO2溫箱內孵育培養44～48 h。然后將96孔板中的培養液棄去，自然風干，甲醇固定，碘染液染色10～20 min后在顯微鏡下觀察。能夠抑制包涵體生長的最低藥物濃度就是該藥對沙眼衣原體的MIC。

1.2.3 次抑菌濃度誘導耐藥 參考Dessus-Babus等人[4]的方法，在傳代的MEM生長培養液中同時加入次抑菌濃度（1/2MIC)的紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素3種抗生素，用12孔聚乙烯板進行沙眼衣原體的接種與收集。連續傳代，每4代測定其對抗菌藥物的MIC，當測得MIC≥4倍誘導前MIC，則誘導耐藥成功，臨床株變異為耐藥株[5]。

1.2.4 L4核糖體蛋白 （1）制備耐藥株、敏感株和標準株基因組DNA。（2）引物根據文獻[6]設計，引物上游 L4-F 5′AAGCGTTCTTGCGGAGTAG 3′，引物下游 L4-R 5′GCCTTCTCGGTCACATAATGTC 3′。PCR 25 μl擴增體系：上游 2.5 μl終濃度 0.3 μmol/L，下游2.5 μl終濃度 0.3 μmol/L，模板 2.5 μl終濃度 100～200 ng，Mix 12.5 μl，無菌雙蒸水補足至 25 μl混勻。PCR擴增條件：96℃預變性10 min；96℃變性30 s；56～60℃退火30 s；72℃延伸60 s；30個循環后，72℃延伸5～10 min。（3）PCR反應產物的檢測：取產物5 μl，加入1 μl含溴酚藍的loading緩沖液混勻，0.9%瓊脂糖凝膠、80 V電壓下電泳40 min，凝膠成像分析儀下觀察結果，拍攝照片存檔，然后取25 μl PCR反應產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.5 23S rRNA （1）提取菌株的RNA逆轉錄制備cDNA，進行PCR擴增。（2）耐藥基因檢測所用引物根據參考文獻[3]設計，引物上游 rr-f，5′AAGTTCCGACCTGCACGAATGG 3′。引物下游 rr-r，5′TCCATTCCGGTCCTCTCGTAC 3′。PCR 25 μl擴增體系：上游 1.25 μl終濃度 0.3 μmol/L，下游 1.25 μl終濃度0.3μmol/L，模板2.5μl終濃度100～200ng，Mix12.5μl，無菌雙蒸水補足至25 μl混勻。PCR擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性40s；60℃退火40s；72℃延伸60 s；35個循環后，72℃延伸 10 min。（3）PCR 反應產物的檢測：取產物 5 μl，加入 1 μl含溴酚藍的 loading緩沖液混勻，0.9%瓊脂糖凝膠、80 V電壓下電泳40 min，凝膠成像分析儀下觀察結果，然后取25 μl PCR反應產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0進行統計學分析，多個樣本比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析，兩樣本比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 誘導耐藥后的MIC的變化 誘導耐藥后沙眼衣原體耐藥株對紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素的MIC 值分別是誘導前的 4～16，4～16和 4～8倍。Kruskal-Wallis秩和檢驗分析，H=31.68，P<0.05，這3種抗生素對沙眼衣原體耐藥差異有統計學意義。Mann-Whitney U秩和檢驗，紅霉素組/阿奇霉素組u=79.000，P=0.801，兩組間差異無統計學意義；阿奇霉素組/交沙霉素組u=26.500，P=0.002，兩組間差異有統計學意義；紅霉素組/交沙霉素組u=28.000，P=0.003，兩組間差異有統計學意義，見表1。

表1 13例沙眼衣原體誘導耐藥后3種抗生素MIC倍數變化

2.2 核糖體蛋白L4檢測結果

2.2.1 L4目的片段電泳結果 沙眼衣原體菌株擴增其L4，獲得目的片段769bp，見圖1。

圖1 L4擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖1～6 道：不同臨床株；M 為 D2000:100，250，500，750，1000，2000 bp

2.2.2 L4突變結果 將擴增產物進行正方向雙向測序，與美國國立生物技術信息中心（NCBI)數據庫的沙眼衣原體D/UW-3/CX標準序列（GenBank accession number AE001273)比較，結果顯示臨床株和標準株均有相同的突變 G274A、C276T、C339T、C466G，即第113位脯氨酸Pro突變為亮氨酸Leu，第156位脯氨酸Pro突變為丙氨酸Ala（相當于大腸桿菌第109位和第152位)。其中一個標本測序結果見圖2。

圖2 1個標本L4測序結果

2.3 23S rRNA基因檢測結果

2.3.1 23SrRNA目的片段電泳結果 沙眼衣原體菌株擴增其23SrRNA，獲得目的片段725bp，見圖3。

圖3 23SrRNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖1～7 道：不同臨床株；M 為 D2000:100，250，500，750，1000，2000 bp

2.3.2 23SrRNA突變結果 通過與NCBI數據庫的沙眼衣原體D/UW-3/CX標準序列和沙眼衣原體L2b/UCH-1/proctitis標準序列（GenBank accession number NC 010280.1)比較，我們檢測和對比臨床株23S rRNA PCR擴增產物。其中1個耐藥株標本的PCR產物測序結果見圖4。測序分析結果見表2，可以看出耐藥株測序結果中有4例菌株A2057G突變，2例 A2059G突變，2例 A2093T突變，1例C2452A突變，11例T2611C突變，陽性率分別是30.77%，15.38%，15.38%，7.69%和84.62%。

表2 耐藥前后23S rRNA擴增產物突變位點的比較

圖4 1個標本23S rRNA測序結果

3 討論

大環內酯類藥物根據結構分為14環、15環、16環3種。其中，紅霉素屬于14環大環內酯，阿奇霉素屬于15環大環內酯，交沙霉素屬于16環大環內酯類[7]。本實驗選擇了紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素進行次抑菌濃度（1/2）對沙眼衣原體的誘導耐藥，發現連續傳代5次后MIC值保持不變，連續傳8代以上即有MIC升高，20代后MIC≥4倍誘導前MIC即為耐藥變異株。從誘導耐藥連續傳代的過程中發現紅霉素、阿奇霉素的MIC增大出現的時間早于交沙霉素并且增大倍數大于交沙霉素。紅霉素、阿奇霉素與交沙霉素相比，P<0.05認為差異有統計學意義。誘導耐藥之前的敏感株的紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素MIC值分別為 0.5～1 mg/L、0.5～1 mg/L 和 0.04～0.16 mg/L，耐藥株的紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素MIC值分別為2～16 mg/L、4～8 mg/L 和 0.16～0.64 mg/L，與文獻報道的 MIC 值（0.25～1 mg/L、0.125～1 mg/L、0.02～0.16 mg/L)比較表明紅霉素和阿奇霉素的敏感性降低明顯，產生高水平耐藥，而交沙霉素低水平耐藥，這可能與目前該藥物在臨床上很少使用有關。

本研究結果也表明，3種藥物抗沙眼衣原體活性的總趨勢為：16環強于15環和14環。這可能與碳環的增加及對大環內酯類抗生素的結構改造增強了藥物的酸穩定性和延緩了半衰期有關。這提示只要找出耐藥菌株的基因位點，我們就可以改造它們的碳環結構，就可增強藥物的酸穩定性，更好抑制移位酶的活性，阻礙肽鏈的延長和蛋白質合成，從而延緩半衰期，那么就可以減少疾病的復發率。

Birte等[7]總結了23S rRNA的常見突變位點是2057、2058、2059、2452 和 2611。2004 年 Misyurina等[3]報道，發現4株耐藥衣原體標本都存在A2058C、T2611C突變，這些突變在沙眼衣原體中第一次被發現。本研究采用Misyurina的方法，擴增23S rRNA的轉肽酶環編碼基因，著重研究 2057，2058，2059，2452和2611位點突變與耐藥產生是否相關。通過表2可以看出，耐藥株測序結果中有6菌株A2057G突變，2例A2059G突變，2例A2093T突變，1例C2452A突變，11例T2611C突變，沒有出現A2058突變。但菌株號3、11的敏感株在耐藥之前就出現了A2057G突變，與文獻報道的MIC值比較，推測我們制定的天然耐藥標準較高，部分“敏感株”誘導可能已經超過了血藥濃度，已經天然存在很低水平的耐藥。A2058和A2059突變與高水平耐藥有關，而A2057和T2611突變產生低水平耐藥[7]，A2058和A2059點突變陽性率分別是0和15.38%，A2057和T2611點突變陽性率分別是30.77%和84.62%，所以我們認為A2057G、A2059G和T2611C的點突變與大環內酯類藥物耐藥有關，但需要進一步研究。A2093T突變有2例，沒有被報道過，我們認為還是有意義的。C2452A突變同時在9例耐藥株和8例敏感株中出現，可能與個體菌株差異有關，所以我們認為沒有意義。

L4點突變首次報道是在2007年，Binet等[6]發現了沙眼衣原體L2型阿奇霉素耐藥株中L4核糖體蛋白C196A突變，即第66位相當于大腸桿菌第62位核苷酸Gln（谷氨酰胺）突變為Lys（賴氨酸）。

本實驗按照Binet等的方法擴增核糖體蛋白L4 PCR產物，檢測能否出現L4核糖體蛋白C196A突變。PCR產物結果測序沒有C196A突變，而耐藥株和敏感株均有相同的 G274A、C276T、C339T、C466G這4個位點突變，且在高度敏感的標準株中也出現，所以我們認為G274A、C276T、C339T、C466G突變沒有意義。

通過對沙眼衣原體對大環內酯類藥物耐藥的分子生物學機制23S rRNA和核糖體蛋白L4的研究，對臨床合理用藥、監測藥物的耐藥性及避免耐藥性的產生等有重要的意義，也可以使我們對沙眼衣原體的了解更加深入，具有重要的學術價值。

［1］潘正安，劉俊之，楊靑，等.中華人民共和國藥典2000年版二部，臨床用藥須知[M].第3版.北京：化學工業出版社，2001:5877-5877

［2］白樺，佟菊貞，寧波，等.泌尿生殖道沙眼衣原體對19種抗菌素的敏感性研究[J].中華醫學雜志，1995，75（1）：11

［3］Misyurina OY，Chipitsyna EV，Finashutina YP，et al.Mutations in a 23S rRNA gene ofChlamydiatrachomatisassociated with resistance to macrolides [J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48（4):1347

［4］Dessus-Babus S，Bébéar CM，Charron A，et al.Sequencing of gyrase and topoisomerase iv quinolone-gesistance-determin-ing regions of Chlamydia trachomatis and characterization of quinolone-resistant mutants obtained in vitro[J].Antimicrob Agents Chemother，1998，42（10):2474

［5］Michea-Hamzehpour M，Kahr A，Pechere JC.In vitro stepwise selection of resistance to quinolones，beta-lactams and amikacin in nosocomial gram-negative bacilli[J].Infection，1994，22（Suppl 2):S105

［6］Binet R,Maurelli AT.Frequency of development and associated physiological cost of azithromycin resistance in Chlamydia psittaci 6BCandChlamydiatrachomatisL2[J].AntimicrobAgentsChemother，2007,51（12):4267

［7］Vester B，Douthwaite S.Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA [J].Antimicrob Agents Chemother，2001，45（1):1