雞血清對人惡性腫瘤細胞增殖能力的影響

劉翠翠 ，馮文茹 ，趙秀梅 ，劉利萍 ，胡人杰

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市醫藥科學研究所）

血清藥理學系一種新的實驗方法,即將中藥或其復方制劑經口給予動物后采集血清，然后以此作為藥源（含藥血清）進行體外藥理實驗[1]。我們在進行中藥方劑血清藥理學實驗研究中，首先觀察了不同血清（包括家兔、人和雞）對人腫瘤細胞生長的影響。結果發現雞血清對腫瘤細胞生長的影響明顯不同于哺乳類動物血清，它表現出明顯的抑制腫瘤細胞生長的作用。現將我們的具體實驗情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康霞煙雞,10周齡，雌雄不拘，購自天津市靜海縣某專業飼養場。

1.1.2 瘤株 A549人肺癌細胞，MCF-7人乳腺癌細胞，BGC-823人胃癌細胞，由天津市醫藥科學研究所腫瘤藥理室提供。

1.1.3 主要試劑及實驗設備 RPMI-1640培養基干粉(Gibco)；小牛血清(FBS,杭州四季青)；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、MTT（北京欣經科生物技術有限公司）；DMSO（天津市化學試劑三廠）；SRB、Tris(美國Sigma公司)。CO2孵箱（REVCO）；96、12 孔板，5 ml培養瓶（美國Costar公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；普通光學顯微鏡（MADE IN DDR CARL ZWISS JENA）；多功能酶標儀infinite M200（瑞士TECAN公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞血清的制備 無菌條件經翅下靜脈采血，室溫靜置1h徹底凝固后，3000 r/min，離心20 min，分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存，備用，使用前分別用1640營養液配制成不同濃度。

1.2.2 MTT法[2]測定雞血清對3種腫瘤細胞生長狀況的影響 將3種對數生長期的細胞濃度調整為1×104個/ml，加入 96 孔板中，100 μl/孔，37 ℃，5%CO2培養24 h，待細胞貼壁后，棄上清，分別加入終濃度為10%、20%、40%、60%、80%的雞血清，每個濃度設5個復孔，以10%小牛血清為對照，繼續培養48 h，MTT法測定OD值。重復試驗1次。

1.2.3 MTT法與SRB法[2-3]測定雞血清對A549細胞生長狀況的影響 方法同上，將A549細胞加入96孔板中，MTT法及SRB法各一板，同樣條件培養后分別加入終濃度為5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的雞血清，每個濃度設5個復孔，以10%小牛血清作為對照。MTT法及SRB法分別測定培養48 h及72 h的OD值。重復實驗1次。

1.2.4 臺盼藍拒染活細胞計數法 將A549細胞濃度調整為 5×104個/ml，加入培養瓶中，5 ml/瓶，37 ℃，5%CO2培養24 h，細胞貼壁后，棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后，將其分為3組，每組3瓶，分別加入濃度為1%、0.1%的雞血清，5 ml/瓶；對照組加入10%小牛血清，置培養箱中繼續培養，分別于24 h、48 h臺盼藍染色，計數各瓶活細胞數。重復實驗2次。

1.2.5 雞血清對A549細胞形態學影響的觀察 將濃度為5×104個/ml的細胞懸液加入12孔板中，2 ml/孔，同時放入玻片，培養24 h，棄上清，PBS清洗3次，換用1%、0.1%雞血清及10%小牛血清繼續培養，48 h后將玻片取出，PBS清洗5次，細胞固定后，HE染色，光鏡觀察。

2 結果

2.1 MTT法測定雞血清對3種腫瘤細胞生長狀況的影響 由表1看出，與對照組小牛血清培養條件相比較，雞血清作用48 h，對3種腫瘤細胞的生長具有明確的“促進”作用，其OD值明顯增高。但是在同時進行的倒置顯微鏡的觀察中發現，腫瘤細胞生長狀態欠佳，具體表現為細胞皺縮，折光性減弱，并且在視野中可以見到細胞“碎片樣”物質。

表1 MTT法測定雞血清對腫瘤細胞生長的影響(±s,n=5)

表1 MTT法測定雞血清對腫瘤細胞生長的影響(±s,n=5)

與對照組相比，*P<0.05

BGC-8231.15±0.0782.67±0.138*2.57±0.294*2.65±0.183*2.51±0.048*2.50±0.100*MCF-71.24±0.1322.75±0.078*2.84±0.048*2.60±0.087*2.59±0.094*2.60±0.109*組別對照組10%組20%組40%組60%組80%組A5491.05±0.0572.67±0.167*2.73±0.109*2.52±0.094*2.37±0.303*2.33±0.135*

2.2 MTT法及SRB法測定雞血清對A549細胞生長狀況的影響 選擇A549細胞，降低并設計不同濃度的雞血清同時結合SRB法進一步考察雞血清對腫瘤細胞生長的影響。具體結果見表2。同上述實驗相似，雞血清濃度即使低至0.05%時仍表現出“促進”腫瘤細胞生長的作用，且MTT和SRB法測定結果相一致，另外SRB法顯示，這一“促進”作用似乎隨著培養時間的延長而更加明顯。顯微鏡下觀察細胞形態學的變化依然存在。

表2 MTT法和SRB法測定各孔OD值(±s,n=5)

表2 MTT法和SRB法測定各孔OD值(±s,n=5)

與對照組相比，*P<0.05

對照組5.00%組1.00%組0.50%組0.10%組0.05%組MTT法 SRB法組別 72 h 1.18±0.1542.63±0.058*2.32±0.289*2.42±0.171*2.44±0.091*2.34±0.176*48 h 0.17±0.0160.68±0.136*0.49±0.090*0.58±0.125*0.52±0.109*0.54±0.091*72 h 0.28±0.0621.50±0.072*1.53±0.160*1.59±0.216*1.47±0.101*1.19±0.401*48 h 1.38±0.3192.66±0.117*2.58±0.094*2.47±0.135*2.24±0.140*2.28±0.216*

2.3 臺盼藍拒染活細胞計數法結果 表3列出了該方法計數兩種濃度雞血清培養48 h后，A549細胞的存活情況。在雞血清的作用下，腫瘤細胞數量明顯減少（P<0.001），且隨著作用時間的延長這一作用愈加明顯。說明雞血清對人腫瘤細胞具有殺傷作用，這一作用具有時效關系。

表3 活細胞計數法測定結果(±s,n=5)

表3 活細胞計數法測定結果(±s,n=5)

與對照組相比，*P<0.05

細胞數量（104個/瓶）培養時間0 h 24 h 48 h 0.1%濃度組25.00±0.00*18.08±0.58*9.50±1.09*1%濃度組25.00±0.00*12.58±2.16*6.33±1.38*對照組25.00±0.0033.78±6.5486.33±7.51

2.4 細胞形態學觀察 細胞組織形態學變化見圖1~6。從圖中可見，對照組低倍鏡下細胞生長密集，鋪滿整個玻片（圖1），高倍鏡下細胞具有明顯的癌細胞形態特征,胞核圓形或橢圓形,可見核仁，細胞膜完整，細胞生長狀態良好（圖2）。雞血清1%濃度組細胞數量明顯減少，細胞大小和對照組比較明顯變小，細胞核固縮明顯，深染，部分細胞腫脹變性（圖3、4）。0.1%濃度組細胞腫脹變大，邊緣模糊不清，胞漿、胞核變性呈絮狀，空斑增大、變多，胞質呈均一的深伊紅色（圖 5、6）。

圖1 對照組（HE×20）

圖2 對照組(HE×40)

圖3 1%雞血清組（HE×20）

圖4 1%雞血清組（HE×40）

圖5 0.1%雞血清組（HE×20）

圖6 0.1%雞血清組（HE×40）

3 討論

我們在采用MTT法研究多種動物血清對腫瘤細胞生長的影響時發現，與哺乳類動物相比較，雞血清培養可使腫瘤細胞明顯“增殖”，且這種“增殖”與顯微鏡下細胞形態學的變化不符。同時我們還發現，單用雞血清與MTT作用不會產生變色反應，只有當腫瘤細胞和雞血清共同存在的條件下才會出現變色反應（生成甲臢顆粒），且這種反應變化十分迅速，即刻發生，而不同于一般狀態下，孵育4 h后MTT才逐漸反應生成甲臢顆粒。這種現象是否說明雞血清會干擾MTT法的測定？還是細胞確實發生了“增殖”？為此我們又采用了SRB法，臺盼藍拒染活細胞計數法，以及細胞形態學觀察等一系列實驗，以了解雞血清對腫瘤細胞生長真實的影響。

由MTT法及SRB法測定結果來看，雞血清對腫瘤細胞的生長具有明確的“促進”作用，且這種作用在極低的濃度時即可產生，兩種方法檢測結果一致。MTT和SRB檢測原理迥異，MTT法主要同活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活性有關，SRB法則是與活細胞蛋白含量成正比，都是根據OD值的大小評價細胞生長或增殖的情況，且后者比前者具有更高的準確性和穩定性[4-5]，兩種方法具有快速、微量、靈敏的特點，因而廣泛用于生物活性因子的活性檢測、各種器械的安全性評價和細胞學實驗，特別是抗腫瘤藥物的篩選實驗中[6-7]。

臺盼藍拒染法可直接計數活細胞數目，可直觀反映細胞的增殖情況，對確定細胞增殖狀況來說是較為準確可靠的一種方法。在本項實驗中，通過細胞計數法證實雞血清對腫瘤細胞會產生“殺傷作用”，在MTT法和SRB法中所表現出來的“促進”腫瘤細胞增殖作用不過是一種假象，進而我們又通過細胞形態學觀察進一步證實了這一事實，涂片中未見到細胞“碎片樣”物質，可能是因為它們無法貼壁所致，因此在倒置顯微鏡下觀察到的內容在細胞爬片中無法見到。另外，1%和0.1%兩組圖片細胞形態不一致，考慮是因二者生長及凋亡的時間不相平行所致，但并不影響我們對結果的判斷，即細胞損傷甚至死亡。

綜上所述，（1）雞血清對人惡性腫瘤細胞具有殺傷作用；（2）雞血清對人腫瘤細胞的這種殺傷作用不能采用MTT法及SRB法測定，這兩種方法測定會出現“細胞增殖”的假象。至于MTT法及SRB法為何會出現這種現象？是由于雞血清含有某種“物質”可以增強細胞中琥珀酸脫氫酶的活性？還是某種“物質”同腫瘤細胞發生尚未可知的某種反應產生這種假象？有關探索性的工作尚在進行中。

（本項實驗中的組織病理學工作得到天津市醫藥科學研究所病理室聶衛主任的指導，在此表示感謝）

［1］Iwama H，Amagaya S，Oqihara Y.Effect of Shosaikoto，a Japanese and Chinese traditional herbal medicinal mixture，on the mitogenic activity of lipopolysaccharide:a new pharmacological testing method[J].Ethnopharmacol，1987，21（1）：45

［2］Mosmann T.Rapid co1orimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].Immunol Methods，1983，65（12）：55

［3］Skehan P，Storeng R，Scudiero D，et al.New colorimetric cytotoxici cy assay for anticancer-drug screening[J].Natl Cancer Inst，1990，82(13)：1107

［4］郭莉霞，劉建輝，陳剛，等.兩種方法檢測TETA與卡鉑聯用對腫瘤細胞作用的比較[J].毒理學雜志，2007,21（3）:207

［5］羅敏，周媛，宮衛東，等.SRB法檢測大鼠原發肝癌細胞、骨髓間充質干細胞和HepG2細胞的抗腫瘤藥物敏感差異 [J].第四軍醫大學學報,2007,28(12):1069

［6］李國華,龔振宇,于淑湘,等.3Y-TZP全瓷材料體外細胞毒性試驗(MTT法)[J].中國美容醫學,2008,17(3):401

［7］Cruz MT,Duarte CB,Goncalo M,et al.The sensitizer 2,4-dinitrofluorobenzene activates caspase-3 and induces cell death in a skin dendritic cell line[J].Int J Toxicol,2003,22(1):43