乙型肝炎病毒1896位點(diǎn)變異熒光PCR法檢測(cè)及意義

李秀梅 ，湯 華

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,天津市生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津市傳染病醫(yī)院）

乙型肝炎病毒（HBV）的變異是較普遍的現(xiàn)象[1-2]。既往認(rèn)為在HBV感染過(guò)程中，血清HBeAg的消失，抗－HBe的出現(xiàn)意味著病毒復(fù)制的停止與病變活動(dòng)的緩解[3]。然而，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些抗－HBe陽(yáng)性但仍有HBV復(fù)制的活動(dòng)性肝炎患者[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這類肝炎患者體內(nèi)存在一種HBV變異株。HBV前C區(qū)1896位的核苷酸由G變?yōu)锳，導(dǎo)致28位密碼子由色氨酸（TGG）變?yōu)榻K止密碼子（TAG），由于該變異使病毒不能編碼HBeAg，肝細(xì)胞表面靶抗原HBeAg消失，一方面使病毒發(fā)生免疫逃逸，使得HBV得以長(zhǎng)期持續(xù)；另一方面HBeAg的消失還導(dǎo)致免疫耐受性的減退，因而誘發(fā)炎癥活動(dòng)[2，5]。這是HBV最常見的變異，具有重要臨床意義。本文采用熒光PCR法檢測(cè)HBV前C區(qū)1896位點(diǎn)突變，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對(duì)象 2006年5月～2007年8月在傳染病醫(yī)院住院患者74例，男49例，女25例，年齡19～69歲。臨床診斷按照2000年全國(guó)肝炎會(huì)議修訂的標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶者（ASC）10例，急性乙型肝炎（AHB）5例，慢性乙型肝炎（CHB）43例，肝炎肝硬化活動(dòng)期（LC）16例。上述病例血清無(wú)甲、丙、丁、戊肝炎病毒標(biāo)志物（ELISA法），且PCR檢查HBV DNA陽(yáng)性。

1.1.2 試劑 血清標(biāo)志物檢測(cè)所用試劑為華美公司產(chǎn)品。HBV DNA定量檢測(cè)所用試劑為廣州達(dá)安公司產(chǎn)品。熒光PCR法檢測(cè)1896位點(diǎn)變異試劑為杭州博賽基因診斷技術(shù)有限公司產(chǎn)品：包括核酸提取液；HBV1896變異熒光PCR檢測(cè)混合液A和B；酶；HBV DNA陰性血清；HBV1896野生型陽(yáng)性血清；HBV1896變異型陽(yáng)性血清。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 HBV DNA定量檢測(cè) 采用熒光定量PCR法（FQ-PCR）；儀器為美國(guó)PE5700。操作依說(shuō)明書。

1.2.2 HBV 1896位點(diǎn)變異檢測(cè) 熒光PCR法；儀器為美國(guó)PE7300。操作依說(shuō)明書。PCR擴(kuò)增條件：37℃2 min；94℃預(yù)變性2 min；93℃變性 15 s，62℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。熒光檢測(cè)在62℃，反應(yīng)體系為 40 μl。

1.2.3 結(jié)果判定 待檢樣品混合液A和混合液B的熒光檢測(cè)Ct值≤38，判斷待檢樣品為HBV1896野生型；若混合液A檢測(cè)Ct值≤38，混合液B檢測(cè)Ct值為陰性，判斷待檢樣品為HBV1896變異型；如果檢測(cè)Ct值在38～40之間，重復(fù)檢測(cè)1次，如果檢測(cè)Ct值仍在38～40之間，則判為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

74例乙型肝炎患者有41例發(fā)生前C區(qū)1896位點(diǎn)變異，占55.41%。

2.1 乙肝患者不同臨床類型與前C區(qū)1896位點(diǎn)突變的關(guān)系 不同乙肝患者變異檢出率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝14.12，P<0.01）。其中CHB組和 LC組發(fā)生變異的檢出率均高于ASC組（χ2值分別為5.69和4.47，P<0.05)；但CHB組和LC組之間變異檢出率差別卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.13，P>0.05）；AHB 組未檢出變異株,見表1。

2.2 e系統(tǒng)與HBV前C區(qū)1896位點(diǎn)突變的關(guān)系 抗－HBe(+)組變異率明顯高于 HBeAg(+)組（χ2＝11.46，P<0.01），見表 2。

表1 不同類型乙肝患者前C區(qū)1896位點(diǎn)變異的檢出

表2 e系統(tǒng)與HBV前C區(qū)1896位點(diǎn)突變的關(guān)系

2.3 抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量與前C區(qū)1896位點(diǎn)突變的關(guān)系 不同HBV DNA含量組變異檢出率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝10.44，P<0.01）。其中HBV DNA>108copies/mL 組和 107～108copies/mL 組均高于<107copies/mL組（χ2分別為 7.20和 4.59，P<0.05）；但>108copies/mL 組和 107～108copies/mL組之間變異檢出率差別卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.34，P>0.05），見表 3。

表3 45例抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量與1896位點(diǎn)突變的關(guān)系

3 討論

HBV是高度變異的，包括點(diǎn)突變、數(shù)目不等的堿基缺失或插入以及基因組重組，目前國(guó)內(nèi)外研究得最多的一種變異就是導(dǎo)致HBV e抗原消失的前C區(qū)1896位點(diǎn)突變。HBeAg既是病毒復(fù)制和傳染性的指標(biāo)，又被認(rèn)為是一種免疫調(diào)節(jié)因子，可抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)受HBV感染的肝細(xì)胞的攻擊，從而減少對(duì)HBV的免疫清除，可見前C區(qū)終止密碼變異可能與機(jī)體免疫狀態(tài)和疾病的發(fā)展密切相關(guān)[4]。本組74例乙肝患者中，有41例（55.41%）患者發(fā)生了1896位點(diǎn)突變，其中CHB和LC組突變的檢出率高于ASC組。說(shuō)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的炎癥活動(dòng)，HBV在免疫壓力下，發(fā)生了變異，可使乙肝的病情加重或病情遷延，容易發(fā)生重型或慢性肝炎，甚至肝硬化。而AHB和ASC缺乏這樣的經(jīng)歷，很少發(fā)生變異，與駱抗先等[1]報(bào)告一致。

本文對(duì)抗－HBe(+)、HBV DNA(+)但含量不同的45例患者進(jìn)行了HBV 1896位點(diǎn)變異檢測(cè)，結(jié)果71.11%發(fā)生了突變。說(shuō)明隨著HBV DNA含量的增加，其發(fā)生變異的檢出率也增加，變異株與抗－HBe(+)肝炎患者慢性化、病情反復(fù)活動(dòng)有關(guān)。由于該變異使病毒不能編碼HBeAg,導(dǎo)致肝細(xì)胞膜上HBeAg缺失，從而誘導(dǎo)炎癥活動(dòng)，甚至可導(dǎo)致暴發(fā)性肝衰竭甚至肝癌的發(fā)生[5-6]。并且這些病毒變異的單獨(dú)或聯(lián)合發(fā)生與患肝癌風(fēng)險(xiǎn)的增加是相關(guān)的，并可預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生[6-7]

因此，變異與炎癥活動(dòng)可能是一種互為因果的關(guān)系，持續(xù)或劇烈的炎癥活動(dòng)將有利于變異株的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化[8-9]。

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