乙型肝炎病毒1896位點變異熒光PCR法檢測及意義

李秀梅 ，湯 華

（1.天津醫科大學基礎醫學院,天津市生命科學中心實驗室，天津300070；2.天津市傳染病醫院）

乙型肝炎病毒（HBV）的變異是較普遍的現象[1-2]。既往認為在HBV感染過程中，血清HBeAg的消失，抗－HBe的出現意味著病毒復制的停止與病變活動的緩解[3]。然而，近年來發現一些抗－HBe陽性但仍有HBV復制的活動性肝炎患者[4]。進一步研究發現這類肝炎患者體內存在一種HBV變異株。HBV前C區1896位的核苷酸由G變為A，導致28位密碼子由色氨酸（TGG）變為終止密碼子（TAG），由于該變異使病毒不能編碼HBeAg，肝細胞表面靶抗原HBeAg消失，一方面使病毒發生免疫逃逸，使得HBV得以長期持續；另一方面HBeAg的消失還導致免疫耐受性的減退，因而誘發炎癥活動[2，5]。這是HBV最常見的變異，具有重要臨床意義。本文采用熒光PCR法檢測HBV前C區1896位點突變，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 2006年5月～2007年8月在傳染病醫院住院患者74例，男49例，女25例，年齡19～69歲。臨床診斷按照2000年全國肝炎會議修訂的標準，無癥狀乙肝病毒攜帶者（ASC）10例，急性乙型肝炎（AHB）5例，慢性乙型肝炎（CHB）43例，肝炎肝硬化活動期（LC）16例。上述病例血清無甲、丙、丁、戊肝炎病毒標志物（ELISA法），且PCR檢查HBV DNA陽性。

1.1.2 試劑 血清標志物檢測所用試劑為華美公司產品。HBV DNA定量檢測所用試劑為廣州達安公司產品。熒光PCR法檢測1896位點變異試劑為杭州博賽基因診斷技術有限公司產品：包括核酸提取液；HBV1896變異熒光PCR檢測混合液A和B；酶；HBV DNA陰性血清；HBV1896野生型陽性血清；HBV1896變異型陽性血清。

1.2 檢測方法

1.2.1 HBV DNA定量檢測 采用熒光定量PCR法（FQ-PCR）；儀器為美國PE5700。操作依說明書。

1.2.2 HBV 1896位點變異檢測 熒光PCR法；儀器為美國PE7300。操作依說明書。PCR擴增條件：37℃2 min；94℃預變性2 min；93℃變性 15 s，62℃退火延伸1 min，共40個循環。熒光檢測在62℃，反應體系為 40 μl。

1.2.3 結果判定 待檢樣品混合液A和混合液B的熒光檢測Ct值≤38，判斷待檢樣品為HBV1896野生型；若混合液A檢測Ct值≤38，混合液B檢測Ct值為陰性，判斷待檢樣品為HBV1896變異型；如果檢測Ct值在38～40之間，重復檢測1次，如果檢測Ct值仍在38～40之間，則判為陰性。

1.3 統計學方法 計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

74例乙型肝炎患者有41例發生前C區1896位點變異，占55.41%。

2.1 乙肝患者不同臨床類型與前C區1896位點突變的關系 不同乙肝患者變異檢出率差別有統計學意義（χ2＝14.12，P<0.01）。其中CHB組和 LC組發生變異的檢出率均高于ASC組（χ2值分別為5.69和4.47，P<0.05)；但CHB組和LC組之間變異檢出率差別卻無統計學意義（χ2＝0.13，P>0.05）；AHB 組未檢出變異株,見表1。

2.2 e系統與HBV前C區1896位點突變的關系 抗－HBe(+)組變異率明顯高于 HBeAg(+)組（χ2＝11.46，P<0.01），見表 2。

表1 不同類型乙肝患者前C區1896位點變異的檢出

表2 e系統與HBV前C區1896位點突變的關系

2.3 抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量與前C區1896位點突變的關系 不同HBV DNA含量組變異檢出率差別有統計學意義（χ2＝10.44，P<0.01）。其中HBV DNA>108copies/mL 組和 107～108copies/mL 組均高于<107copies/mL組（χ2分別為 7.20和 4.59，P<0.05）；但>108copies/mL 組和 107～108copies/mL組之間變異檢出率差別卻無統計學意義（χ2＝2.34，P>0.05），見表 3。

表3 45例抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量與1896位點突變的關系

3 討論

HBV是高度變異的，包括點突變、數目不等的堿基缺失或插入以及基因組重組，目前國內外研究得最多的一種變異就是導致HBV e抗原消失的前C區1896位點突變。HBeAg既是病毒復制和傳染性的指標，又被認為是一種免疫調節因子，可抑制細胞毒性T細胞對受HBV感染的肝細胞的攻擊，從而減少對HBV的免疫清除，可見前C區終止密碼變異可能與機體免疫狀態和疾病的發展密切相關[4]。本組74例乙肝患者中，有41例（55.41%）患者發生了1896位點突變，其中CHB和LC組突變的檢出率高于ASC組。說明經過長期的炎癥活動，HBV在免疫壓力下，發生了變異，可使乙肝的病情加重或病情遷延，容易發生重型或慢性肝炎，甚至肝硬化。而AHB和ASC缺乏這樣的經歷，很少發生變異，與駱抗先等[1]報告一致。

本文對抗－HBe(+)、HBV DNA(+)但含量不同的45例患者進行了HBV 1896位點變異檢測，結果71.11%發生了突變。說明隨著HBV DNA含量的增加，其發生變異的檢出率也增加，變異株與抗－HBe(+)肝炎患者慢性化、病情反復活動有關。由于該變異使病毒不能編碼HBeAg,導致肝細胞膜上HBeAg缺失，從而誘導炎癥活動，甚至可導致暴發性肝衰竭甚至肝癌的發生[5-6]。并且這些病毒變異的單獨或聯合發生與患肝癌風險的增加是相關的，并可預測肝癌的發生[6-7]

因此，變異與炎癥活動可能是一種互為因果的關系，持續或劇烈的炎癥活動將有利于變異株的優勢轉化[8-9]。

［1］駱抗先，楊潔，李秀惠，等.前C區A83點突變在乙型肝炎病毒感染中的分布[J].中華醫學雜志，1994，74(8):478

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［3］趙素元，夏志剛.乙肝病毒變異后病毒核酸、乙肝三系、轉氨酶的相關性[J].中國醫學檢驗雜志,2007,8(5):324

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［5］王健,王平平.乙肝病毒變異與免疫逃避 [J].現代預防醫學,2006,33(9):1553

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