火絨草抗急性炎癥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)初步研究

姜 鴻， 侯 政， 邸子真， 王光函， 尤獻民

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽110034)

火絨草Leontopodium leontopodioides(Willd.)Beauv為菊科火絨草屬植物的干燥全草。我國主要分布于東北、西北、華北及西南地區(qū)，青藏高原，在遼寧范 圍內(nèi)多生長于針葉、闊葉林交界處的低矮草叢中。火絨草味微苦，性寒;入腎、膀胱二經(jīng);具有清熱涼血、消炎利腎的功效。其對流行性感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創(chuàng)傷出血等癥狀有一定的治療作用。

本研究利用極性萃取法將火絨草提取液分離成不同極性化學(xué)成分群，對不同化學(xué)成分群進行抗急性炎癥試驗，將藥效學(xué)實驗結(jié)果與各提取物指紋圖譜峰相對峰面積相關(guān)聯(lián)，通過SPSS統(tǒng)計軟件的相關(guān)分析初步確定火絨草藥材與抗急性炎癥作用相關(guān)的色譜峰，為火絨草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 提取物制備

取火絨草藥材，加水10倍量和8倍量分別提取2次，每次提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至體積與藥材投料比約為1∶2時，放涼，量取1/2溶液，濃縮并減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，加糊精稀釋成1 g樣品含10 g藥材的粉末，作為1號提取物;剩余1/2溶液置分液漏斗中，分別用等倍量石油醚(30～60℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取5次，分別合并各自萃取溶液，回收溶劑，減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，分別加入糊精適量，配制成1 g樣品含10 g藥材的粉末:2號提取物(石油醚層)、3號提取物(乙酸乙酯層)、4號提取物(正丁醇層);取經(jīng)過上述溶劑萃取后的水溶液，濃縮并減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，加糊精適量，配制成1 g樣品含10 g藥材的粉末，作為5號提取物。

2 提取物指紋圖譜分析

2.1 儀器與試藥 Agilent 1100高效液相色譜分析儀:四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、DAD檢測器、全自動進樣器(美國Agilent公司)。乙腈、磷酸為色譜純;娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純;火絨草藥材采自于沈陽東陵祝家地區(qū)。

2.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C185 μ(200 mm×4.6 mm);流動相A:0.2%磷酸水溶液，B:乙腈;梯度洗脫。流速:1 mL/min;DAD檢測器，檢測波長:290 nm;柱溫:25℃;譜圖記錄60 min。

2.3 供試品溶液制備 取1項下1～5號提取物各適量，分別精密稱取2 g，加蒸餾水50 mL，稱重，回流提取1 h，靜置冷卻至室溫，稱重，用蒸餾水補足減失重，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，分別取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 HPLC指紋圖譜分析 取各供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，5個提取物以提取物1為準(zhǔn)共得到36個色譜峰，見圖1～圖5，用X1～X36分別代表各色譜峰校正后的峰面積，見表1。

圖1 提取物1指紋圖譜

圖2 提取物2指紋圖譜

將原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸混合對照溶液進樣，記錄色譜圖，并將保留時間與樣品各指紋峰比較，確認10號峰為原兒茶酸、13號峰為原兒茶醛、14號峰為綠原酸、16號峰為咖啡酸，見圖6。

圖3 提取物3指紋圖譜

圖4 提取物4指紋圖譜

圖5 提取物5指紋圖譜

圖6 照品溶液HPLC圖

表1 火絨草提取物的峰面積

3 提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用

選取72只昆明種小白鼠，隨機分為6組，每組12只，分別為空白對照組，1、2、3、4、5號提取物組。各組動物按相應(yīng)劑量灌胃給予相對應(yīng)藥液，給藥容積均為20 mL/kg，空白對照組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后，在小鼠右耳正反兩面用微量加樣器各滴加20 μl二甲苯致炎。20 min后各小鼠脫臼處死，剪下左右兩耳，以9 mm打孔器打下兩個耳片，電光天平稱重，計算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率，腫脹度=右耳－左耳;腫脹抑制率=［(空白對照組腫脹度均值－用藥組腫脹度均值)/空白對照組腫脹度均值］×100%。結(jié)果見表2。

由表2試驗結(jié)果可見，與空白對照組比，3號提取物有極顯著差異，1號提取物有顯著差異，其余各提取物無顯著性差異。

4 數(shù)據(jù)處理

4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 將指紋圖譜化學(xué)數(shù)據(jù)(表1)和抗炎試驗數(shù)據(jù)(表2)組成原始數(shù)據(jù)矩陣，自變量X1～X36代表各色譜峰校正后的峰面積，因變量Y代表藥理指標(biāo)-腫脹抑制率，組成矩陣，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用相關(guān)分析的方法探討火絨草藥材中可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 火絨草提取物對小鼠耳腫脹度的影響(n=10、±s)

表2 火絨草提取物對小鼠耳腫脹度的影響(n=10、±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01(下同)。

/%空白對照組別 腫脹度/mg 腫脹抑制率7.74±1.36 2.647.95±1.12 -1號提取物 5.89±1.28* 25.912號提取物 7.82±1.23 1.643號提取物 5.39±1.53** 32.204號提取物 7.42±1.51 6.675號提取物

4.2 相關(guān)分析 相關(guān)分析(Correlate)是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計方法。有雙變量相關(guān)分析(Bivariate)、偏相關(guān)分析(Partial)等。當(dāng)分析多個變量之間的關(guān)系，而這種關(guān)系又往往是變量之間的數(shù)量關(guān)系時，通常采用雙變量相關(guān)分析方法。使用SPSS軟件(13.0版)中的雙變量相關(guān)分析可以得到變量兩兩之間的皮爾遜系數(shù)(Pearson Correlation Coefficients)及其統(tǒng)計量。表3列出的是雙變量相關(guān)分析(Bivariate)方法處理所得的Pearson相關(guān)系數(shù)。

表3 36個色譜峰的相對峰面積與抑制率相關(guān)分析結(jié)果(皮爾遜系數(shù))

與 Y 相關(guān)的變量有:X7、X13、X16、X30、X31、X35、X36;與 Y密切相關(guān)的變量有:X11、X14、X24、X28、X34。通過相關(guān)分析，這12個化學(xué)組分可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

4.3 回歸分析 采用“有進有出”的回歸分析方法，從一個自變量開始，視各個自變量X對因變量Y作用程度的顯著，將顯著變量逐個引入回歸方程，而原引入的變量因后引入的新變量而變得不顯著時，則將其剔除，每一步都進行F檢驗，以保證方程中只包含顯著變量。這個過程反復(fù)進行直到再無新變量引入，也無變量被剔除，逐步回歸完成，建立回歸方程。共有X6、X15、X18、X36等20個變量被引入回歸方程。

X6、X18化學(xué)組分與提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用負相關(guān)，與藥效預(yù)期的結(jié)果相反，因此被剔除。

X15、X36化學(xué)組分與腫脹的抑制作用正相關(guān)，可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質(zhì)成分。在分析過程中同時發(fā)現(xiàn)有多重共線性情況，X36與 X7、X11、X13、X14、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35等 12 個組分顯著正相關(guān)，這 12 個化學(xué)組分也應(yīng)是火絨草抗急性炎癥的藥效物質(zhì)成分。因此經(jīng)過回歸分析，X7、X11、X13、X14、X15、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35、X36等14個組分可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

5 討論

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥現(xiàn)代化的研究核心，以中藥的主要功效和配伍理論為指導(dǎo)，采用恰當(dāng)?shù)乃幚砟Ｐ驮u價藥效，利用現(xiàn)代分離、分析技術(shù)篩選、提取、分離與藥效密切相關(guān)的化學(xué)成分群，進而闡明化學(xué)成分與藥理活性的關(guān)系，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代化基礎(chǔ)研究的主要內(nèi)容。

本研究將指紋圖譜技術(shù)運用于其復(fù)雜成分的化學(xué)信息的采集，將化學(xué)信息與藥理實驗結(jié)果相關(guān)聯(lián)，對其進行降維處理，得出與藥效相關(guān)性比較大的少數(shù)組分作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探索了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的思路。綜上所述，研究了中藥火絨草的色譜指紋圖譜和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從36個色譜峰中有效地抽提出14個變量初步確定為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進行了有意義的探索，對中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也有一定的借鑒意義。

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