大鼠實驗性結腸炎結腸黏蛋白分泌異常及馬齒莧多糖干預研究

張 濤， 潘 峰， 陳建永， 王小平， 施 斌

(1.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405;2.杭州市紅會醫院，浙江杭州310003;3.江西中醫藥高等專科學校，江西臨川344700;4.杭州市第一人民醫院，浙江杭州310000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因尚不明確、反復發作，腸道非特異性炎癥性疾病。該病的發病機制尚不明確，但研究表明，黏蛋白的分泌和硫酸化的異常在UC的發生、發展中占據重要地位［1］。TNBs單劑灌腸誘導大鼠結腸炎模型，不需預先致敏動物或進行外科手術，而且損傷可以復制，具有簡單易行，重現性好，與人類UC相似的特點，是UC發病機制研究及防治藥物療效評估的比較理想的實驗動物模型［2］。本課題在中醫藥理論指導下，以公認有效的美沙拉嗪為陽性對照，觀察馬齒莧多糖緩解TNBs誘導大鼠結腸炎的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級♂性SD大鼠48只，體重為(200±20)g，浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。美沙拉嗪(商品名惠迪，佳木斯鹿靈制藥有限公司生產，批號H19980148)，5%2，4，6TNBs，購自 Sigma 公司(貨號:P2297)。無水乙醇購自上海國藥集團。HID-AB(高鐵雙胺-奧辛藍)、AB-PAS(過碘夫酸-奧辛藍)黏蛋白特殊染色試劑購自上海鈺森生物試劑有限公司。

馬齒莧多糖提取:稱取粉碎的馬齒莧干品粉末10 g，甲醇回流脫去表面脂肪，抽濾，藥渣風干。再用80%乙醇回流除去小分子糖、苷類、生物堿等，藥渣風干。然后分別取藥渣5 g，以水作為溶劑對藥渣進行多糖提取。水提液離心去除雜質，減壓濃縮至小體積，加無水乙醇至濃度75%沉淀;靜置24 h后過濾，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數次，真空干燥，得馬齒莧多糖(polysaccharide of Portulaca oleracea，POP)，用蒽酮-硫酸比色法檢測多糖含量為8.5%，60℃烘干備用。得率為10 g×8.5%=0.85 g。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UC模型復制:所有SD大鼠稱重后，按體重隨機分4組，其中正常組12例，模型組12例，中藥治療組12例，西藥對照組12例。除正常組外，其余36只SD大鼠先給予25%烏拉坦，按0.35 mL/100 g腹腔麻醉。參照Morris GP法改良［3］TNBs造模最佳劑量100 mg/kg計算，用1 mL注射器抽吸TNBs原液(0.18 mL/100 gSD大鼠)，繼續抽吸0.25 mL的50%乙醇混合后，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm后注入混合試劑，倒置夾肛2 h。6 h后觀察造模動物，約75%大鼠出現稀便和血便。3 d后除正常組同步飼養外，模型組予0.33 mL生理鹽水灌胃，中藥治療組予POP水溶液200 mg/0.33 mL灌胃，西藥對照組予美沙拉嗪水溶液22 mg/0.33 mL灌胃，連續用藥7 d［4］。各組治療結束后處死動物。迅速剖取距肛8 cm遠端結腸，置于10%中性甲醛液固定。

1.2.2 HE染色觀察組織學損傷評分:將已用10%中性甲醛固定好的大鼠結腸取出，然后切取病變處，經用流水沖洗，放入生物脫水機進行逐級脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片4 μm，常規HE染色，封片，光鏡下觀察炎癥和潰瘍情況。評分標準參照文獻［5］，具體見表1。

表1 UC光鏡下結腸組織損傷評分標準

1.2.3 結腸黏蛋白特殊染色:采用HID-AB、AB-PAS法，具體步驟嚴格按試劑盒說明進行操作。

2 結果

2.1 結腸黏膜損傷情況和損傷評分比較 模型組肉眼可見結腸黏膜糜爛重，潰瘍表淺多而且大;光鏡下見黏膜嚴重充血、水腫，大量炎性細胞浸潤，潰瘍周圍的腺體擴張，腺上皮細胞輕度增生。中藥治療組肉眼可見結腸黏膜糜爛程度減輕，潰瘍小，黏膜充血;光鏡下見愈合性小潰瘍，黏膜及黏膜下層輕度充血、水腫，炎性細胞浸潤。西藥對照組肉眼可見結腸黏膜糜爛程度減輕，潰瘍數量少，水腫程度較模型組輕淺;光鏡下結腸壁黏膜面見愈合性小潰瘍，腸壁各層充血、水腫，炎性細胞浸潤，見表2。

表2 大鼠UC結腸組織損傷評分(±s)

表2 大鼠UC結腸組織損傷評分(±s)

注:經F檢驗，治療組與模型組比較，△P<0.01;對照組與模型組比較，*P<0.01;治療組與模型組對比，P>0.05。

組別 例數 肉眼損傷評分 光鏡損傷評分正常組12 0 0模型組 12 7.36±0.27 4.45±0.20治療組 12 2.46±0.15△ 3.12±0.12△對照組 12 2.58±0.10* 3.23±0.14*

2.2 結腸黏蛋白特殊染色結果 采用Image-pro PLUS 4.1版圖像分析軟件，每個樣本隨機選取3個高倍視野，采用灰度值120～145，計算陽性細胞數占總細胞數的百分比，對結腸黏膜黏蛋白的表達進行定量分析。模型組大鼠結腸黏蛋白分泌減少，治療組大鼠結腸黏蛋白分泌增加，兩組比較，有統計學意義(P<0.01)。見表3。

3 討論

臨床研究發現，以馬齒莧為君藥的中藥復方清腸栓治療潰瘍性結腸炎療效顯著［6］。但馬齒莧具體有效成分尚不明確，因而本研究在前期工作的基礎上，開展馬齒莧有效部位的研究。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧(Portulaca oleracea L.)的干燥地上部分，首載于《神農本草經》。《本草綱目》記載:“其葉并比如馬齒，而性滑利似莧，故名。”又名馬齒草，春夏二季采收，除去殘根及雜質，洗凈，略蒸或燙后曬干。性味酸寒，歸肝、大腸經。功效主治:清熱解毒，涼血止血。《食療本草》指出其能“煮粥止痢及疳痢”。POP為馬齒莧提取物的有效成分，具有顯著提高正常家兔淋巴細胞和PHA誘導的淋巴細胞的增殖能力，通過提高細胞免疫功能，從而調節機體的免疫功能［7］。本研究通過組織形態學評分發現模型組大鼠結腸潰瘍較多而且表淺，結腸黏膜明顯充血、水腫，大量炎性細胞浸潤;治療組予POP干預7 d后，鏡下觀察大鼠結腸未見明顯潰瘍，結腸黏膜輕度充血、水腫，少量炎性細胞浸潤。治療組與對照組療效相似，表明POP具有明確緩解大鼠實驗性結腸炎的效應。

表3 大鼠結腸黏蛋白特殊染色分析(±s)

表3 大鼠結腸黏蛋白特殊染色分析(±s)

注:經F檢驗，治療組與模型組相比，*P<0.01;對照組與模型組比較，△P<0.01;治療組與對照比較，P>0.05。

/%AB-PAS 0.16±0.03 0.06±0.03 0.12±0.01 0.13±0組別 正常組/% 模型組/% 治療組/% 對照組.01 HID-AB 0.13±0.02 0.05±0.010.10±0.02* 0.11±0.01△

晚近研究提示，UC與黏蛋白合成、分泌異常密切相關［8］。結腸黏蛋白是一種由柱狀上皮細胞和結腸杯狀細胞分泌的糖蛋白，起保護結腸黏膜的作用;它由寡糖通過O-糖苷鍵與黏液蛋白骨架上的絲氨酸或蘇氨酸殘基結合而成的。黏蛋白在上皮細胞表面形成具有潤滑作用并抵抗機械破壞及腸腔內有害物質侵襲的保護層。與胃、小腸的黏蛋白相比，結腸的黏蛋白硫酸化程度明顯增高，硫酸化后的黏蛋白能抵制腸腔內細菌對黏液的酶解作用，從而更好地保護結腸黏膜，故在結腸中硫酸化后的黏蛋白更為重要，黏蛋白硫酸化程度的降低對結腸黏膜膠體層中的黏液是極其不利的［9］。

本實驗結果發現，模型組大鼠結腸黏膜杯狀細胞數目減少、杯狀細胞中黏蛋白合成減少、黏液膠體層變薄、黏蛋白硫酸化的程度也降低，且黏蛋白減少量與局部炎癥程度有關，炎癥越嚴重，黏蛋白減少越明顯;予POP干預7 d后，杯狀細胞的數目及其黏蛋白分泌的表現均見明顯恢復。這表明POP可能通過刺激結腸黏蛋白的合成及分泌，促進TNBs所致大鼠結腸炎損傷黏膜的修復和潰瘍愈合。

［1］Amit-Romach E，Reifen R，Uni Z.Mucosal function in rat jejunum and ileum is altered by induction of colitis［J］.Int J Mol Med.2006，18(4):721-727.

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［4］徐叔云，卞如濂，陳 修主編.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛生出版社，2002，1860-1861.

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