小鼠Lewis肺癌細胞Foxp3的表達對T淋巴細胞增殖的影響及機制①

歷 春 蓋曉東 賈 婷 付海英 李 一 (吉林大學白求恩醫學院免疫學系,長春130021)

Foxp3(forkhead box P3)屬于叉頭轉錄因子家族中的一員,是CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells,Tregs)特異性的表面標志和發育及功能的決定因素[1,2]。Tregs是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群,在維持機體自身耐受過程中具有重要作用[3,4]。此外,Tregs還參與腫瘤的免疫逃逸,在腫瘤組織及腫瘤患者外周血中均檢測到Foxp3的高表達[5-7]。最新研究發現Foxp3在胰腺癌等腫瘤細胞內也有表達[8-13],而腫瘤細胞表達Foxp3是否與腫瘤的免疫逃逸相關尚不明確。因此,為了研究腫瘤細胞表達的Foxp3是否參與腫瘤的免疫逃逸,本研究檢測小鼠Lewis肺癌(LLC)細胞Foxp3的表達,構建pcDNA3.1-Foxp3真核表達載體,將其轉染小鼠LLC細胞,檢測Foxp3過表達對T淋巴細胞的增殖和TGF-β1、IL-10表達的影響,探討LLC 細胞中Foxp3表達在腫瘤免疫逃逸中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 pcDNA3.1(+)質粒(Invitrogen公司);膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、MMLV反轉錄酶 、Ex Taq DNA 聚合酶 、T4 DNA 連接酶 、DNA marker、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶均為Takara公司產品;Foxp3單克隆抗體(eBiscience公司)、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術公司;FuGENE HD(Roche);TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒均購自武漢博士德公司;刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司。

1.2 實驗動物 吉林大學實驗動物中心提供C57BL/6小鼠7只,雌性,4～6周齡,體重18～22克。

1.3 細胞培養 小鼠LLC細胞用含10%新鮮小牛血清的DMEM培養液于37℃,5%CO2孵箱培養。

1.4 RT-PCR檢測細胞中目的基因的表達 Trizol試劑提取細胞總RNA,逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板,PCR儀擴增目的基因片段。Foxp3引物為:上游:5′-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3′;下 游 :5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′。擴增條件:預變性94℃2分鐘,(變性94℃30秒,退火 60℃30秒,延伸72℃1分鐘),共進行35個循環,最后72℃延伸10分鐘。擴增產物為 382 bp。TGF-β1引物為:上游 :5′-GCCCTGGATACCAACTATTGC-3′;下 游 :5′-GCAGGAGCGCACAATCATGTT-3′。擴增條件 :預變性94℃2分鐘,變性 94℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃1分鐘,共進行26個循環,最后72℃延伸10分鐘。擴增產物為 360 bp。IL-10引物為:上游:5′-GCTCTTACTGACTGGCAT-3′;下 游:5′-GGCCTTGTAGACACCTTGGT-3′。擴增條件:預變性 94℃2分鐘,變性94℃30秒,退火56℃30秒,延伸 72℃1分鐘,共進行35個循環,最后72℃延伸10分鐘。擴增產物為 440 bp。內參 β-actin 引物為:上游:5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′;下游 5′-TAAAAC GCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。擴增條件:預變性94℃2分鐘,(變性 94℃30秒,退火52℃30秒,延伸72℃1分鐘),共進行25個循環,最后72℃延伸10分鐘。擴增產物為320 bp。引物由上海生工有限公司合成。

1.5 免疫組化檢測LLC細胞Foxp3蛋白的表達 LLC細胞經預冷的PBS洗滌,冷丙酮固定10分鐘,PBS清洗后加內源性過氧化物酶阻斷劑15分鐘,PBS清洗后加血清室溫封閉30分鐘,加大鼠抗小鼠Foxp3(1∶100),并用PBS做陰性對照,于4℃冰箱孵育過夜。次日用PBS清洗,加羊抗大鼠IgG(1∶100)室溫孵育40分鐘,PBS清洗后加DAB顯色5分鐘,用自來水沖洗3分鐘終止反應,然后依次進行蘇木素襯染、鹽酸水化及封固。每張切片在400倍顯微鏡下隨機選取300個細胞,著色強度分為:不著色(-);淺黃色(+);黃色(++);棕黃色(+++)。將結果按下列公式計算:Foxp3蛋白表達積分=(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3。

1.6 pcDNA3.1-Foxp3真核表達載體的構建和鑒定 Trizol試劑提取小鼠脾細胞總RNA,逆轉錄成cDNA,擴增Foxp3全長開放讀碼框。根據GeneBank中小鼠Foxp3的mRNA基因全序列(AY357712)設計引物,功能片段約為1300 bp。上游引物為5′-CCA ATG CCC AACCCT AGG C-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點),下游引物為 5′-CAGT CTC GAG TCAAGGGCA GGGATT GGAGCA C-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。PCR產物和pcDNA3.1載體分別用EcoRⅠ和XhoⅠ作雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收并純化產物,T4 DNA連接酶連接后產物轉化DH5α,涂板篩選陽性克隆。陽性克隆用EcoRⅠ/XhoⅠ作雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序鑒定。

1.7 FuGENE HD介導的重組質粒pcDNA3.1-Foxp3瞬時轉染LLC細胞 轉染前24小時,消化LLC細胞,細胞以5×105個/孔接種六孔板。實驗分3組:LLC組,pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組。轉染當日,細胞達到80%融合。轉染前1小時各組均更換新鮮完全培養液,pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組分別取2μg質粒DNA(pcDNA3.1及pcDNA3.1-Foxp3),加入無血清的DMEM培養液至總體積為100μl,輕輕混勻,室溫放置。分別取FuGENE HD 6μl,加入上述DNA稀釋液中,輕輕混勻,室溫放置15分鐘后將轉染工作液輕輕混勻,分別逐滴加入 pcDNA3.1-LLC組及 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組培養液中,輕輕混勻培養液,置37℃,5%CO2孵箱培養。

1.8 C57BL/6小鼠脾淋巴細胞的制備 將C57BL/6小鼠斷髓處死,無菌取脾臟,研磨后用淋巴細胞分離液分離,收集中間乳白色層制成脾淋巴細胞懸液,用PBS洗滌2次,離心(1 500 r/min,5分鐘),重新懸浮于PBS,計數并調細胞濃度。

1.9 淋巴細胞轉化試驗檢測轉染Foxp3的LLC細胞對T淋巴細胞增殖的影響 分別取瞬時轉染48小時后 LLC組、pcDNA3.1-LLC組及 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細胞以1×104個/孔(100μl)接種96孔板中,待細胞貼壁后加入絲裂霉素C至終濃度25 μg/ml,置于細胞培養箱中37℃、5%CO2條件下培養2小時。以1×105個細胞/孔(100μl)的密度將脾淋巴細胞接種于已接種LLC細胞的96孔板中,同時設單純淋巴細胞組作為對照組,DMEM培養液作為空白調零,以ConA(終濃度5 mg/L)刺激淋巴細胞轉化,每組5個復孔。

收集瞬時轉染48小時后LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的培養上清,置于96孔培養板,每孔100μl。加入分離的脾淋巴細胞懸液100μl(1×105個細胞)/孔,分組同上,以ConA(終濃度5 mg/L)刺激淋巴細胞轉化,每組5個復孔。

以上各孔均于37℃、5%CO2條件下培養72小時;每孔加MTT溶液至MTT終濃度為0.5mg/ml,繼續培養4小時;每孔加入DMSO 150μl,震蕩 10分鐘;使用酶標儀測定各孔的光密度值,檢測波長為570 nm。淋巴細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.10 ELISA檢測培養上清中TGF-β1和IL-10的濃度 分別取LLC組、pcDNA3.1-LLC組和pcDNA3.1-Foxp3-LLC組瞬時轉染48小時后的培養上清,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA),參照試劑盒說明檢測其中分泌的TGF-β1和IL-10蛋白含量,檢測波長為450 nm。

1.11 統計學處理 采用SPSS 12.0統計軟件進行分析,樣本均數比較采用t檢驗,P＜0.05為有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 LLC細胞Foxp3 mRNA的表達 為了證實Foxp3在LLC細胞中的表達,首先采用RT-PCR方法從基因水平對LLC細胞進行Foxp3 mRNA的檢測,結果顯示2個LLC細胞樣本在382 bp處均有目的條帶出現,與陽性對照脾細胞Foxp3條帶相符,但沒有脾細胞表達強;陰性對照NIH-3T3細胞無Foxp3 mRNA表達;初步表明小鼠LLC細胞表達Foxp3。見圖1。

2.2 LLC細胞Foxp3蛋白的表達 為進一步證實LLC細胞中Foxp3在蛋白水平的表達,對LLC細胞進行了免疫組化檢測。結果顯示,Foxp3蛋白在LLC細胞中呈陽性表達,表現為細胞核內棕黃色均勻細顆粒,但著色較淺,見圖2。此結果進一步證明LLC細胞表達Foxp3。

2.3 重組質粒pcDNA3.1-Foxp3的構建

2.3.1 Foxp3全長基因的擴增結果 為進一步研究Foxp3在LLC細胞表達的可能作用,構建pcDNA3.1-Foxp3重組質粒。首先擴增小鼠Foxp3全長基因。結果小鼠脾細胞總RNA經RT-PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳顯示在約1.3 kb處可見一明顯擴增條帶,與Foxp3全長基因片段長度相符,見圖3。

2.3.2 重組質粒pcDNA3.1-Foxp3的酶切電泳鑒定 為鑒定重組質粒pcDNA3.1-Foxp3,采用EcoRⅠ和XhoⅠ內切酶對重組質粒進行酶切電泳鑒定。經雙酶切的重組質粒pcDNA3.1-Foxp3和pcDNA3.1空質粒分別電泳后,前者出現了1.3和5.4 kb兩條帶(1.3 kb為Foxp3 cDNA產物,5.4 kb為pcDNA3.1線狀質粒),而pcDNA3.1空質粒則只有5.4 kb一條帶,初步表明重組質粒構建成功,見圖4。

圖1 Foxp3 mRNA在LLC細胞的表達Fig.1 The expression of Foxp3 mRNA in LLC cells

圖2 免疫組化結果顯示LLC細胞表達Foxp3蛋白(×400)Fig.2 The expression of Foxp3 protein in LLC cells by IHC

圖3 Foxp3的PCR產物電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis result of Foxp3 PCR products

圖4 重組質粒pcDNA3.1-Foxp3酶切后的電泳鑒定Fig.4 Enzyme-cutting identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-Foxp3 by EcoRⅠand XhoⅠ

圖5 pcDNA3.1-Foxp3轉染LLC細胞后Foxp3 mRNA的表達水平Fig.5 The expression level of Foxp3 mRNA in LLCcells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3

2.3.3 重組質粒pcDNA3.1-Foxp3的測序鑒定 為進一步證實重組質粒為pcDNA3.1-Foxp3,對重組質粒進行了測序,結果證實所克隆的基因為小鼠Foxp3。

2.4 瞬時轉染LLC細胞48小時后Foxp3 mRNA的表達 為證實轉染后Foxp3的高表達,采用RT-PCR方法從基因水平對LLC細胞進行了檢測。結果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3 mRNA表達較LLC組和pcDNA3.1-LLC組明顯增強(P＜0.01),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組中Foxp3mRNA表達之間無明顯差異(P＞0.05)。見圖5、6,結果證明LLC細胞轉染pcDNA3.1-Foxp3后Foxp3基因表達上調。

圖6 pcDNA3.1-Foxp3轉染LLC細胞后Foxp3 mRNA的表達水平Fig.6 The expression level of Foxp3 mRNA in LLC cells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3

圖7 pcDNA3.1-Foxp3轉染LLC細胞后Foxp3蛋白的表達水平(×400)Fig.7 Theexpression level of Foxp3 protein in LLC cells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3(×400)

2.5 瞬時轉染48小時后LLC細胞Foxp3蛋白的表達 為進一步證實Foxp3基因是否成功轉入LLC細胞,對轉染48小時后的細胞進行免疫組化檢測。結果顯示,LLC組和pcDNA3.1-LLC組Foxp3蛋白著色較淺,且較均勻;而pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白的著色較深,且深淺不一,見圖7。LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白表達積分分別為(184.7±4.73)%、(188.6±5.68)%及(221.7±7.64)%。pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白表達積分與LLC組和pcDNA3.1-LLC組比較差異有顯著性(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組中Foxp3蛋白表達之間無明顯差異(P＞0.05)。結果提示pcDNA3.1-Foxp3被成功導入LLC細胞,并能高表達Foxp3蛋白。

2.6 轉染Foxp3的LLC細胞對T淋巴細胞增殖的影響 為研究LLC細胞Foxp3對T淋巴細胞增殖的影響,采用淋巴細胞轉化試驗,將轉染Foxp3的LLC細胞及其上清分別與ConA刺激下的脾淋巴細胞共培養72小時。結果顯示,LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的LLC細胞及其上清均可使T淋巴細胞的增殖受到抑制,且 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的LLC細胞及其上清對T淋巴細胞增殖的抑制作用更為顯著,與LLC組和pcDNA3.1-LLC組比較有統計學意義(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組之間無明顯差異(P＞0.05),見表1、表2。以上結果提示LLC細胞中的Foxp3可抑制T淋巴細胞的增殖,其作用方式可能是通過細胞接觸的方式或促進某種細胞因子的分泌而實現的。

表1 轉染Foxp3的LLC細胞對T淋巴細胞增殖的影響(±s,%)Tab.1 The effect of Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation±s,%)

表1 轉染Foxp3的LLC細胞對T淋巴細胞增殖的影響(±s,%)Tab.1 The effect of Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation±s,%)

Note:Compared with LLC group,1)P＜0.05;Compared with pcDNA3.1-LLC group,2)P＜0.05.

Groups Inhibitory rate of T cell proliferation LLC 21.58±0.08 pcDNA3.1-LLC 16.78±0.06 pcDNA3.1-Foxp3-LLC 47.08±0.051)2)

表2 轉染Foxp3的LLC細胞上清對T淋巴細胞增殖的影響(±s,%)Tab.2 The effect of the supernatant from cultured Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation(±s,%)

表2 轉染Foxp3的LLC細胞上清對T淋巴細胞增殖的影響(±s,%)Tab.2 The effect of the supernatant from cultured Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation(±s,%)

Note:Compared with LLC group,1)P＜0.05;Compared with pcDNA3.1-LLC group,2)P＜0.05.

Groups Inhibitory rate of T cell proliferation LLC 14.68±0.07 pcDNA3.1-LLC 11.78±0.03 pcDNA3.1-Foxp3-LLC 37.58±0.061)2)

2.7 轉染 Foxp3的LLC細胞對TGF-β1和IL-10 mRNA和蛋白表達的影響 為研究LLC細胞中Foxp3對T淋巴細胞增殖抑制作用的可能機制,采用RTPCR和ELISA方法檢測Foxp3過表達對免疫抑制因子TGF-β1和IL-10 mRNA和蛋白表達的影響。結果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組細胞中 TGF-β1和 IL-10 mRNA表達較LLC組、pcDNA3.1-LLC組明顯增強(P ＜0.05),見圖 8、圖 9;同時 ,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組培養上清中TGF-β1和IL-10蛋白的含量較LLC組、pcDNA3.1-LLC組也均有顯著增加(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組之間無明顯差異(P＞0.05),見圖10。結果提示,LLC細胞中Foxp3可能通過上調免疫抑制因子TGF-β1和IL-10的表達從而抑制T淋巴細胞的增殖。

圖8 轉染 Foxp3的LLC細胞對 TGF-β1和IL-10 mRNA表達的影響Fig.8 Theeffect of Foxp3 transfected LLCcells on mRNA expression of TGF-β1 and IL-10

圖9 轉染 Foxp3的LLC細胞對 TGF-β1和IL-10 mRNA表達影響Fig.9 Theeffect of Foxp3 transfected LLCcells on mRNA expression of TGF-β1and IL-10

圖10 轉染 Foxp3的LLC細胞培養上清對TGF-β1和IL-10蛋白分泌的影響Fig.10 The effect of Foxp3 transfected LLC culture supernatant on protein secretion of TGF-β1 and IL-10

3 討論

目前Foxp3仍然被認為是Tregs的一個最特異標志,在腫瘤免疫逃逸機制中發揮重要作用[14]。最新研究發現,Foxp3在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞的細胞核或胞漿內也有表達[8-13]。Hinz等[8]發現TGF-β2可誘導胰腺癌腫瘤細胞中Foxp3的表達,通過小干擾RNA方法特異地抑制腫瘤細胞Foxp3表達后,IL-6、IL-8的表達上調。Merlo等[9]對397例乳腺癌標本的研究顯示Foxp3的表達與患者總生存率密切相關,可作為臨床預測預后的獨立因子。而Zuo等[10]對乳腺癌的研究顯示Foxp3可以抑制癌基因SKP2轉錄,并抑制乳腺癌腫瘤細胞的生長。本實驗通過RT-PCR和免疫組化方法分別檢測了小鼠LLC肺癌細胞株Foxp3的mRNA和蛋白表達。結果顯示Foxp3在mRNA和蛋白水平均有表達,而且免疫組化結果顯示Foxp3蛋白主要分布于細胞核,表明Foxp3在小鼠LLC細胞主要為核表達。

Tregs在腫瘤免疫中發揮免疫抑制作用,而Foxp3在腫瘤細胞表達的作用尚不明確。本實驗探討LLC細胞中Foxp3的作用是否和在Tregs中一樣通過抑制T淋巴細胞的增殖而參與腫瘤的免疫逃逸過程。首先構建pcDNA3.1-Foxp3真核表達載體,將其瞬時轉染LLC細胞,通過RT-PCR和免疫組化方法從基因和蛋白水平證實了Foxp3的過表達。淋巴細胞轉化試驗結果顯示,LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細胞及其上清均可抑制T淋巴細胞的增殖轉化,并且pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細胞及其上清對T淋巴細胞增殖的抑制作用更為顯著。結果表明在有無細胞直接接觸的情況下,Foxp3均可顯著抑制T淋巴細胞的增殖。因此推測Foxp3在LLC細胞的作用可能與其在Tregs中的作用一樣通過抑制T淋巴細胞的增殖參與腫瘤的免疫逃逸。

TGF-β1和IL-10是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制分子。TGF-β1作為TGF-β超家族的成員,是一種強大的免疫抑制因子,可通過多種機制促進腫瘤的惡性進展[15]。IL-10對多種免疫細胞有抑制作用,從而介導免疫抑制。有研究報道Foxp3在Tregs發揮免疫抑制的主要機制之一是通過細胞間直接接觸或分泌TGF-β1和IL-10的方式直接或間接參與了腫瘤免疫逃逸的過程[16,17]。為此,我們檢測了Foxp3過表達的LLC細胞中 TGF-β1和 IL-10的mRNA和蛋白表達。結果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細胞中TGF-β1和IL-10 mRNA表達水平較 LLC組、pcDNA3.1-LLC組均明顯增強,而且其培養上清中TGF-β1和IL-10蛋白的濃度較LLC組、pcDNA3.1-LLC組均顯著增加。表明LLC細胞中的Foxp3與免疫抑制因子TGF-β1和IL-10密切相關,LLC細胞中Foxp3抑制T淋巴細胞的增殖作用可能是通過上調TGF-β1和 IL-10 的表達,促進TGF-β1 和 IL-10 的分泌而實現的。同時本研究還發現,轉染Foxp3的LLC細胞上清對T淋巴細胞增殖的抑制作用弱于轉染Foxp3的LLC細胞與T淋巴細胞直接接觸時的抑制作用,提示除了免疫抑制因子TGF-β1和IL-10的作用外,可能還有其他機制參與其中,有待進一步研究。

以上研究表明,小鼠LLC細胞Foxp3可能通過上調TGF-β1和IL-10的表達抑制T淋巴細胞的增殖從而參與腫瘤的免疫逃逸。因此,在腫瘤微環境中,不僅Tregs發揮免疫抑制作用促進腫瘤的免疫逃逸,同時,腫瘤細胞表達的Foxp3也參與了腫瘤的免疫逃逸作用。深入研究腫瘤細胞Foxp3在腫瘤免疫逃逸過程中的作用機理將會為腫瘤的免疫治療提供新的靶位和治療途徑。

1 Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003;299:1057-1061.

2 Fontenot JD,Rasmussen JP,Williams L M et al.Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3[J].Immunity,2005;22:329-341.

3 Lim H W,Hillsamer P,Banham AH et al.Cutting edge:direct suppression of B cells by CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Immunol,2005;175(7):4180-4183.

4 Marson A,Kretschmer K,Frampton G et al.Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation[J].Nature,2007;445:931-935.

5 Miller A M,Lundberg K,Ozenci V et al.CD4+CD25 high T cells areenriched in the tumor and peripheral blood of prostate cancer patients[J].J Immunol,2006;177:7398-7405.

6 Le Gouvello S,Bastuji-Garin S,Aloulou N et al.High prevalence of Foxp3 and IL17 in MMR-proficient colorectal carcinomas[J].Gut,2008;57(6):772-779.

7 Jensen H K,Donskov F,Nordsmark M et al.Increased intratumoral FOXP3-positive regulatory immune cells during interleukin-2 treatment in metastatic renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2009;15:1052-1058.

8 HinzS,Pagerols-Raluy L,Oberg HH et al.Foxp3expression in pancreatic carcinoma cells as a novel mechanism of immune evasion in cancer[J].Cancer Res,2007;67:8344-8350.

9 Merlo A,Casalini P,Carcangiu M L et al.FOXP3 expression and overall survival in breast cancer[J].J Clin Oncol,2009;27(11):1746-1752.

10 Zuo T,Liu R,Zhang H et al.FOXP3 is a novel transcriptional repressor for the breast cancer oncogene SKP2[J].JClin Invest,2007;117:3765-3773.

11 Ebert LM,Tan B S,Browning J et al.The regulatory T cell-associated transcription factor Foxp3 is expressed by tumor cells[J].Cancer Res,2008;68:3001-3009.

12 Lu H.Foxp3 expression and prognosis:role of both thetumor and T cells[J].J Clin Oncol,2009;27(11):1735-1736.

13 Raskin L,Rennert G,Gruber S B et al.Foxp3 germline polymorphisms are not associated with riskof breast cancer[J].Cancer Genet Cytogenet,2009;190(1):40-42.

14 Gallimore A,Godkin A.Regulatory Tcells and tumour immunity-observations in mice and men[J].Immunology,2008;123:157-163.

15 Moustakas A,Pardali K,Gaal A et al.Mechanisms of TGF-βsignaling in regulation of cell growth and differentiation[J].Immunology Letters,2002;82(1-2):85-91.

16 Strauss L,Bergmann C,Szczepanski M et al.A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+T cells secreting interleukin-10 and transforming growthfactor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment[J].Clin Cancer Res,2007;13:4345-4354.

17 Larmonier N,Marron M,Zeng Y et al.Tumor derived CD4+CD25+regulatory T cell suppression of dendritic cell function involves TGF-beta and IL-10[J].Cancer Immunol Immunother,2007;56:48-59.