肺癌患者外周血T淋巴細胞亞群變化特點及臨床意義①

鄒 靜 劉 斌 陳雪華 李寧麗 王 利

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院呼吸科,上海200127)

肺癌發病率高,預后差。肺癌的發病率在我國居于各惡性腫瘤之首位,達38.46/10萬,現有的特別針對晚期肺癌的治療效果欠佳,總體5年生存僅8%～14%。故探討肺癌的免疫機制,以助改善預后有必要性。免疫監視是機體免疫系統的功能之一,即指在生理狀態下免疫系統能夠清除出現的突變細胞及早中期腫瘤細胞,在防止腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用。另一方面,腫瘤負荷使宿主免疫系統的功能失衡。肺癌患者的免疫狀態與患者的腫瘤臨床病理學特征以及與預后的關系成為近年來的腫瘤研究焦點之一。T細胞分為CD4+、CD8+T細胞,根據細胞表面分子又分為幾大亞類,在維持機體免疫平衡中均起著各自的作用。近年來研究發現,調節性T細胞(Treg,CD4+CD25+Foxp3+)是一類具有免疫調節功能的T細胞亞群,在維持機體免疫自穩、調控免疫應答方面起重要作用。在抗腫瘤免疫中,Treg發揮抑制效應[1],主要表現在Treg占全T細胞的比例上升;Treg與CD8+T細胞相互接觸作用后抑制了CD8+T細胞的殺傷效應[2]。同時,Treg可增加抑制性細胞因子的分泌;去除Treg可以抑制腫瘤生長等。CD3+γδT細胞是體內固有免疫中的一個重要T細胞群,它廣泛分布于消化系統和呼吸系統上皮組織內,末梢血中也有一定數量的γδT細胞。隨著對γδT細胞結構和功能研究的不斷深入,人們發現γδT細胞除了有與αβT細胞類似的一些功能特征外,還有其他的一些獨特的功能,如識別抗原不需要MHC分子提呈,直接識別蛋白質和肽類抗原以及非肽類抗原,具有抗原提呈細胞的一些特征,并能通過細胞接觸和分泌的細胞因子起免疫調節作用。近年來,應用γδT細胞基因敲除的小鼠證明,CD3+γδT細胞在腫瘤免疫監視中具有重要的作用[3,4]。本研究采用流式細胞術檢測技術檢測肺癌患者外周血單個核細胞(PBMC)中各亞類T細胞:總T細胞、Th細胞(CD3+CD4+)、Tc細胞(CD3+CD8+)、NKT 細胞(CD3+CD16+CD56+)、調節性 T 細胞、CD3+γδT 細胞和NK細胞(CD3-CD16+CD56+)水平的變化,探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集上海交通大學附屬仁濟醫院呼吸科2008年～2009年間肺癌患者外周血,共56例,年齡46～84平均 66.3歲,其中,男 41例、女 15例,早中期(Ⅰ～Ⅲa)20例,晚期(Ⅲb～Ⅳ)36例。健康組為18例正常健康志愿者,年齡33～70平均58.3歲,其中男10例、女8例。

1.2 直接免疫熒光標記法 分別抽取56名患者和18例正常健康志愿者外周抗凝血2 ml,采用直接免疫熒光標記法進行抗體標記實驗。簡述之:取上述抗凝血100μl,于每一管中,并分別直接加入10μl PreCP標記鼠抗人CD3、FITC標記鼠抗人CD4、PE標記鼠抗人CD8、PE-Cy5標記鼠抗人 CD25、PE標記鼠抗人 CD127和PE標記鼠抗人TCRγδ(BD Pharmingen,San Diego,California,USA),連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應,同時加入FITC標記小鼠IgG、PE標記小鼠IgG、PreCP標記小鼠IgG和 PE-cy5標記小鼠IgG作為同型對照(BD Pharmingen),并充分混勻,避光,于室溫中孵育30分鐘后,加入4 ml紅細胞裂解液,室溫中繼續孵育30分鐘裂解紅細胞,離心1 500 r/min 5分鐘,用PBS(pH 7.2～7.4)洗1～2次,加入0.4%多聚甲醛-PBS緩沖液重懸細胞,上FACS流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測后,用CELL Quest軟件進行數據分析。

1.3 流式細胞儀檢測 FACS流式細胞儀檢測CD3+占淋巴細胞比例,CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+δT+、CD16+CD25+細胞占CD3+T細胞比例,CD4+CD25+調節性T細胞(以檢測CD4+CD25+CD 127dim作為表達Foxp3+的CD4+CD25+調節性T細胞)占CD4+T細胞比例。

1.4 數據處理 研究資料用SPSS11.5統計軟件進行t檢驗及單因素方差分析,P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 肺癌患者組與健康組T細胞亞群的統計分析

肺癌患者組與健康組在性別、年齡比較差異無顯著性(P＞0.05)。本文分析了56例早中期(Ⅰ～Ⅲa)20例(年齡53～77平均66.3歲,男14例、女6例)和晚期(Ⅲb～Ⅳ)36例肺癌患者(年齡46～84平均66.6歲,男27例、女9例)。表 1所示,56例肺癌患者總T細胞(CD3+)比例明顯低于健康組 61.41%±7.88%vs 71.63%±5.59%(P＜0.001),肺癌患者CD3+CD8+(Tc)細胞比例明顯低于健康組23.58%±7.18%vs 28.44%±5.20%(P＜0.05),而CD3+CD4+(Th)細胞、NKT細胞都有所降低,但差異尚不具統計學意義(P＞0.05)。數據提示,肺癌患者的CD3+T細胞和CD3+CD8+(Tc)細胞的數量較健康對照組存在顯著差異,而這些亞群細胞的數量和功能缺陷與肺癌患者的疾病進程和轉歸有關,見表1。

2.2 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者T細胞亞群的比較 分析肺癌組56例患者,其中早中期(Ⅰ～ Ⅲa)20例(年齡53～77平均66.3歲,男14例、女6例)和晚期(Ⅲb～Ⅳ)36例肺癌患者(年齡46～84平均66.6歲,男27例、女9例),健康組、早中期組和晚期組在性別、年齡比較無顯著差異(P＞0.05)。

2.2.1 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+、Tc、Th細胞亞群的比較 早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者與健康組比較外周血CD3+比例同樣顯著降低64.28%±5.56%vs 71.63%±5.59%,60.25%±8.25%vs 71.63%±5.59%(P＜0.001);CD3+CD8+(Tc)比例低于健康組23.39%±7.22%vs 28.44%±5.20%,23.70%±7.30%vs 28.44%±5.20%(P＜0.05);CD16+CD56+比例低于健康組 14.13%±7.28%vs 18.74%±6.39%,15.53%±5.04%vs 18.74%±6.39%(P＜0.05);CD 3+CD4+(Th)細胞有所降低,但差異尚不具統計學意義(P＞0.05),詳見表2,圖1。

表1 健康組與肺癌患者T細胞亞群與臨床病程關聯性分析(±s)Tab.1 Correlation analysis of T lymphocyte subsets between health group and lung cancer group( ±s)

表1 健康組與肺癌患者T細胞亞群與臨床病程關聯性分析(±s)Tab.1 Correlation analysis of T lymphocyte subsets between health group and lung cancer group( ±s)

Note:Health group vs lung cancer 1)P＜0.05,2)P＜0.01,3)P＜0.001.

T lymphocyte subsets Health(n=18)Lung cancer(n=56)CD3+ 71.63±5.593) 61.41±7.883)CD3+CD4+(Th) 38.60±6.05 34.79±7.18 CD3+CD8+(Tc) 28.44±5.201) 23.58±7.181)CD3-CD16+CD56+(NK) 18.74±6.391) 15.02±7.611)CD3+CD16+CD56+(NKT) 2.53±1.52 1.80±1.36 Treg cell 3.65±2.003) 6.20±1.633)CD3+γδT cell 5.53±1.872) 3.35±1.412)

表2 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+、Tc、Th 細胞亞群的比較(±s)Tab.2 Correlation analysis of CD3+,Tc,Th lymphocyte subsets among health group,early-middle stage and later stage of lung cancer group(±s)

表2 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+、Tc、Th 細胞亞群的比較(±s)Tab.2 Correlation analysis of CD3+,Tc,Th lymphocyte subsets among health group,early-middle stage and later stage of lung cancer group(±s)

Note:Health groups vs early-middle stage,1)P＜0.01;Health groups vs later stage,2)P＜0.001;Health groups vs early-middle stage,3)P＜0.05;Health groups vs later stage,4)P＜0.05.

T lymphocyte subsets Health(n=18)Early-middle stage(n=20)Later stage(n=36)CD3+ 71.63±5.591)2) 64.28±5.56 60.25±8.25 CD3+CD4+(Th)38.60±6.05 37.17±7.03 34.42±7.20 CD3+CD8+(Tc)28.44±5.203)4) 23.39±7.22 23.70±7.30

2.2.2 健康組、早中期肺癌組與晚期組肺癌組患者CD3+γδT細胞表達分析 CD3+γδT 細胞具有拮抗腫瘤的重要臨床意義,而以腹腔腫瘤和結直腸癌更具關聯性。雖然肺癌早中期和肺癌晚期組外周血CD3+γδT細胞比例與健康組比較顯著降低2.64%±1.41%vs 5.53%±1.87%(P＜0.01),3.70%±1.89%vs 5.53%±1.87%(P＜0.01),重要的意義在于早中期肺癌組與晚期肺癌組間的CD3+γδT細胞比例的統計具有統計學差別(P＜0.05)。結果見表3,圖2的FACS圖示。

圖1 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+、Tc、Th細胞亞群的比較Fig.1 Comparison of CD3+,Tc,Th lymphocyte subsets between patients of early-middle stage and that of later stage

表3 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+γδT細胞亞群的比較(±s)Tab.3 Correlation analysis of CD3+γδT lymphocyte subsets among health group,early-middlestage and later stage of lung cancer group(±s)

表3 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD3+γδT細胞亞群的比較(±s)Tab.3 Correlation analysis of CD3+γδT lymphocyte subsets among health group,early-middlestage and later stage of lung cancer group(±s)

Note:Health groups vs early stage,health groups vs later stage,1)P＜0.01,2)P＜0.01;Early and middle stage vs later stage,3)P＜0.05.

T lymphocyte subsets Health(n=18)Early-middle stage(n=20)Later stage(n=36)CD3+γδT cell 5.53±1.871)2)2.64±1.413) 3.70±1.89

圖2 早中期肺癌組與晚期組肺癌組患者CD3+γδT細胞表達分析Fig.2 Theexpression of CD3+γδT cells in PBMC of lung cancer patients in early-middlestageand later stage

表4 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者Treg細胞亞群的比較(±s)Tab.4 Correlation analysis of Treg lymphocyte subsets among health group,early-middlestage and later stageof lung cancer group(±s)

表4 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者Treg細胞亞群的比較(±s)Tab.4 Correlation analysis of Treg lymphocyte subsets among health group,early-middlestage and later stageof lung cancer group(±s)

Note:Health group vsearly-middle stage,1)P＜0.001;Health group vslater stage,2)P＜0.01;Early-middle stage vs later stage,3)P＜0.05.

T lymphocyte subsets Health(n=18)Early-middle stage(n=20)Later stage(n=36)Treg cell 3.65±2.001) 5.06±1.22 6.78±2.64

圖3 健康組早中期肺癌組患者與晚期肺癌組患者Treg細胞的統計分析Fig.3 The analysis of Treg cell in health group and lung cancer patients with early-middle stage and later stage

表5 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD16+CD56+細胞亞群的比較(±s)Tab.5 Correlation analysis of CD16+CD56+lymphocyte subsets among health group,early-middle stage and later stage of lung cancer group( ±s)

表5 健康組、早中期肺癌組患者與晚期組肺癌患者CD16+CD56+細胞亞群的比較(±s)Tab.5 Correlation analysis of CD16+CD56+lymphocyte subsets among health group,early-middle stage and later stage of lung cancer group( ±s)

Note:Health group vs early-middle stage,1)P＜0.05;Health groups vs later stage,2)P＜0.05.

T lymphocyte subsets Health(n=18)Early-middle stage(n=20)Later stage(n=36)CD3-CD16+CD56+(NK)18.74±6.391)2)14.13±7.28 15.53±5.04

圖4 肺癌早中期與肺癌晚期組CD16+CD56+細胞的比較Fig.4 The comparison of CD16+CD56+in lung cancer patients with early-middle stageand later stage

2.2.3 健康組、早中期肺癌組患者與晚期肺癌組患者Treg細胞的統計分析 通過分析肺癌患者早中期組和晚期組Treg細胞發現:其比例較健康對照組顯著增高5.06%±1.22%vs 3.65%±2.00%(P＜0.001),6.78%±2.64%vs 3.65%±2.00%(P＜0.001),而有別于上述T細胞亞群在肺癌不同臨床期的表現。且晚期肺癌組Treg細胞較早中期肺癌組明顯提高并具有統計學差別(P＜0.05)。見表4,圖3所示。

2.2.4 健康組、肺癌早中期與肺癌晚期組CD16+CD56+細胞的比較 CD16+CD56+細胞(NK)在拮抗腫瘤中具有重要意義,目前認為NK細胞的數量和功能表現與腫瘤的發生發展具有密切關聯。本實驗研究發現肺癌早中期和肺癌晚期組外周血CD16+CD56+細胞比例較健康組降低14.13%±7.28%vs 18.74%±6.39%,15.53%±5.04%vs 18.74%±6.39%(P＜0.05),而早中期肺癌組與晚期組肺癌組之間CD16+CD56+細胞未見統計學差別(P＞0.05),見表5,圖4。

3 討論

在生理狀態下機體免疫系統的免疫監視的作用是清除出現的突變細胞及早中期腫瘤細胞,具有防止腫瘤發生的作用。許多研究表明,多種淋巴細胞如CD8+細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)、NK細胞等均參與腫瘤免疫。腫瘤的發生是腫瘤細胞逃避機體免疫監視的結果,導致腫瘤宿主免疫功能紊亂,其可能的逃避機制:①腫瘤可能通過不表達MHCⅠ類分子,下調T細胞的激活表位;腫瘤分泌的免疫抑制因子,如IL-10、TGF-β可誘導針對腫瘤特異性抗原的免疫耐受[5,6]。②腫瘤細胞分泌趨化因子CCL22趨化調節性T細胞至腫瘤局部,發揮免疫抑制效應[7]。

機體抗腫瘤免疫的主要方式是細胞免疫,T細胞、NK細胞和巨噬細胞是最主要的效應細胞,MHCⅠ類分子限制的CTL和MHCⅡ類分子限制的CD4+輔助性T細胞(helper T cell,Th)可分別識別腫瘤抗原肽,它們在一系列輔助信號的參與下,被誘導激活并介導抗腫瘤免疫反應。自然殺傷T細胞(Nature killer T cells,NKT)既具有T細胞表面標志,同時也表達NK細胞相關標記如CD16CD56或CD161(人NKR.P1A、小鼠NK1.1抗原)。

本實驗使用流式細胞術檢測法分析了來自于肺癌早中期和晚期的58例患者的外周血的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+、CD3-CD16+CD56+T細胞的比例,結果顯示各組:健康組,腫瘤組(早中期組、晚期組)經統計分析,肺癌患者外周血總 T細胞 CD3+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD56+(NK)、Treg細胞、CD3+γδT 細胞數量較健康組明顯下降,差異具有顯著性(P＜0.05);而CD3+CD4+(Th)和CD3+CD16+CD56+(NKT)細胞在兩組間無明顯差異(P＞0.05)。惡性腫瘤患者CD4+T細胞亞群的改變情況報道不一,但是多數研究顯示:CD4+T細胞亞群在惡性腫瘤患者中是表現為減少的[9-11]。但數據呈現出隨著疾病進展,晚期組患者Th、NK、NKT較健康組、早中期組呈下降趨勢。

CD4+CD25+調節性T細胞是新近鑒定的一群免疫調節細胞,于1995年由Sakaguchi等[12]首先報道的,該細胞亞群在胸腺中分化成熟,是一組具有免疫調節(或免疫抑制)作用的細胞群,是健康個體T細胞庫的組成成份,占CD4+T細胞的5%～15%。深入研究發現具有免疫調節潛力的CD4+CD25+調節性T細胞就是限制自身免疫反應的重要因素之一[13]。

本實驗是直接通過流式細胞儀技術(FCM)檢測肺癌患者和健康對照人群組外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞和γδT細胞的分布情況。結果顯示①肺癌患者到晚期,其外周血中Treg細胞分別與健康對照組和肺癌早中期組比較均明顯升高,提示宿主腫瘤免疫處于免疫抑制狀態。②Treg細胞數量隨著腫瘤的進展而有上升趨勢,這與既往Sasada等[14]對149例胃癌患者及7例出現腹膜轉移的胃癌患者外周血中檢測Treg細胞數量實驗顯示,其數量越高,患者預后越差的結果是相一致的;提示可能Treg細胞比例越高,宿主預后越差。

γδT細胞從肺癌腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中分離獲得,并發現這些細胞對新鮮自體腫瘤細胞和K562細胞具有高效殺傷活性,許多作者證實了在直腸癌、腎癌、肝癌和乳腺癌等實體瘤的TIL中存在γδT細胞,并具有抗腫瘤作用[15-18]。本實驗發現腫瘤組外周血CD3+γδT細胞比例(3.35%±1.41%)顯著低于健康組(5.53%±1.87%)。這與國內學者發現食管癌患者外周血γδT細胞水平顯著低于正常人群的結果相似[19]。但實驗同時發現一個有趣的現象,即肺癌患者晚期組與肺癌早中期組比較外周血CD3+γδT細胞比例顯著增高,(3.70%±1.89%vs 2.64%±1.41%,P＜0.05)。人們對腫瘤免疫學認識不斷深入的基礎上提出了“腫瘤免疫編輯”,即是指機體免疫系統殺傷腫瘤的同時,腫瘤的惡性程度逐漸增加,導致免疫系統和腫瘤的力量對比失衡,最終可導致機體死亡的過程。腫瘤免疫編輯是一個動態發展的過程,主要由3個階段組成:清除、均衡及逃逸。腫瘤晚期患者可能已經歷免疫均衡期,機體的免疫系統雖能識別和殺傷腫瘤組織,但并不一定能將其完全清除。經過免疫清除后,存活下來的弱免疫原性腫瘤細胞和免疫系統之間可以動態平衡的狀態共處,產生了對免疫攻擊具有更強耐力的腫瘤細胞。雖然晚期肺癌患者γδT細胞數量上較早中期患者顯著增高,但其真正的抗腫瘤細胞的功效卻可能并非與其細胞數量呈正比關系。本實驗結果顯示腫瘤患者T細胞數量較健康組明顯降低,CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞隨著腫瘤疾病的進展其水平呈逐漸上升的趨勢,腫瘤組外周血CD3+γδT細胞比例顯著低于健康組,提示腫瘤宿主抗腫瘤免疫水平低下,處于免疫抑制狀態,而本文試圖從早中期肺癌組和晚期肺癌組患者間的比較發現不僅晚期肺癌組較早中期肺癌組的CD3+γδT細胞具有增高的傾向且其兩組Treg細胞也具有統計學差異,表明調節性T細胞和CD3+γδT細胞也與肺癌的臨床病程具有一定的關聯性。

目前國內外關于腫瘤患者體內亞類T細胞改變的報道是不盡相同的,提示T細胞在機體腫瘤免疫中的作用和地位不能單從T細胞數量上來判斷機體的免疫狀態,還應從T細胞功能,如分泌細胞因子、細胞毒性、細胞活性等方面綜合考慮分析,因此今后關于腫瘤患者T細胞的研究應該從多方面,多角度來分析總結,為腫瘤的免疫治療提供一些線索。

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