生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)①

劉 梅 趙 琰 肖 汀 王雅坤 金光玉 陳洪鐸 何春滌

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科衛(wèi)生部免疫皮膚病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng)110001)

瘢痕形成是創(chuàng)傷修復(fù)的必然結(jié)果,但過(guò)度修復(fù)會(huì)引起成纖維細(xì)胞功能的異常,導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。瘢痕組織可以發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變而成為皮膚瘢痕癌(Skin scar carcinoma,SSC),癌變組織病理學(xué)以鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱鱗癌,Squamous cell carcinoma,SCC)最多見(jiàn)[1]。皮膚鱗癌是最常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤之一,其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚惡性腫瘤的20%[2]。皮膚鱗癌侵襲性和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),臨床危害大[3]。生存素基因是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因,是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成員,它能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成并抑制細(xì)胞凋亡[4]。目前許多研究表明,生存素基因的表達(dá)是癌變發(fā)生的早期事件,且與腫瘤的演進(jìn)、預(yù)后、復(fù)發(fā)及患者的存活率有一定關(guān)系[5-7]。因而,針對(duì)生存素基因的靶向治療成為近年的研究熱點(diǎn)。我們采用免疫組化方法檢測(cè)生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗癌組織中表達(dá)情況,并對(duì)其臨床病理意義進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例與標(biāo)本 所有石蠟標(biāo)本均為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科1981～2008年間手術(shù)切除經(jīng)HE染色確診標(biāo)本,其中瘢痕疙瘩41例,皮膚瘢痕癌35例,鱗癌46例。35例皮膚瘢痕癌標(biāo)本經(jīng)組織病理證實(shí)均為鱗癌。所有病例活檢術(shù)前均未放射治療或化療。另以10例正常皮膚組織為對(duì)照。根據(jù)未分化癌細(xì)胞所占的百分比和細(xì)胞非典型性的程度,即Broders提出的分級(jí)法,將鱗癌病理分為4級(jí)。Ⅰ級(jí):瘤團(tuán)侵入深度不超過(guò)汗腺水平,瘤團(tuán)周圍基底層部分完整,部分則排列紊亂或消失,與周圍基質(zhì)分界不清。分化良好的鱗狀細(xì)胞占75%以上,大多數(shù)細(xì)胞間橋發(fā)育良好,角珠數(shù)量多,真皮炎癥反應(yīng)明顯。Ⅱ級(jí):瘤團(tuán)一般與周圍基質(zhì)界限不清,分化良好的鱗狀細(xì)胞占50%以上,僅有少量角珠,有相當(dāng)多而異形細(xì)胞。Ⅲ級(jí):瘤團(tuán)與周圍間質(zhì)分界不清,分化良好的鱗狀細(xì)胞占25%以上,許多部位角化現(xiàn)象消失,不見(jiàn)角珠。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞核呈非典型性,核分裂像明顯。Ⅳ級(jí):瘤團(tuán)中正常鱗狀細(xì)胞少于25%,絕大多數(shù)為異形,角化現(xiàn)象幾乎完全缺乏,無(wú)細(xì)胞間橋。在皮膚瘢痕癌中,Ⅰ級(jí)18例,Ⅱ級(jí)13例,Ⅲ級(jí)4例;男性19例,女性16例;年齡39～80歲,平均(59.31±9.75)歲,其中≥50歲28例;原發(fā)病為燒傷17例,尋常狼瘡14例,外傷4例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。在皮膚鱗癌中,Ⅰ級(jí)16例,Ⅱ級(jí)21例,Ⅲ級(jí)9例;男性25例,女性21例;年齡35～79歲,平均(55.67±13.82)歲,其中≥50歲34例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。在瘢痕疙瘩中,男性26例,女性15例;年齡 22～64歲,平均(37.43±18.64)歲,其中≥50歲16例。

1.1.2 主要試劑 生存素單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。SP試劑盒、二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法 免疫組化采用鏈霉親和素過(guò)氧化酶(SP)法,抗原修復(fù)采用微波修復(fù)法,生存素抗體稀釋度為1∶100。石蠟切片脫蠟和水化后,采用微波抗原修復(fù),先后滴加過(guò)氧化酶阻斷劑(試劑1),正常非免疫動(dòng)物血清(試劑2),一抗(生存素),生物素標(biāo)記的二抗(試劑3),抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶溶液(試劑4),室溫下孵育10分鐘。PBS沖洗3次,每次3分鐘。DAB顯色,自來(lái)水沖洗,蘇木素復(fù)染,自來(lái)水沖洗返藍(lán),梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固。

1.3 結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。陽(yáng)性結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。低倍鏡下選取染色最均勻的區(qū)域,高倍鏡下計(jì)數(shù),每張切片任意選5個(gè)不同的高倍視野(×400),每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取其平均數(shù)求陽(yáng)性率。采用Sinicrope改良法(半定量積分法)[8]。先根據(jù)染色深淺計(jì)分:1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)深棕色斑塊。再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:0分＜5%,1分5%～25%,2分26%～50%,3分51%～75%,4分＞75%。二者相乘即為該片的積分,積分≤1記為陰性,＞1記為陽(yáng)性。所有染色切片均由2名病理學(xué)工作者盲法判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SAS 8.2軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用率或構(gòu)成比描述分類資料;不同組間率或構(gòu)成比比較采用 χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存素蛋白在皮膚瘢痕癌、鱗癌、瘢痕疙瘩及正常皮膚中的表達(dá) 生存素在皮膚瘢痕癌、鱗癌、瘢痕疙瘩皮損中均呈陽(yáng)性表達(dá),胞漿均呈現(xiàn)黃色或棕黃色,而胞核不著色;正常皮膚組織中未見(jiàn)生存素蛋白表達(dá)(圖1A-D)。

按陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)判斷,在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中,生存素蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率分別為31.71%(13/41)、54.29%(19/35)、60.87%(28/46)。兩兩之間進(jìn)行比較,皮膚瘢痕癌與鱗癌的生存素蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于瘢痕疙瘩(P值均＜0.05),而皮膚瘢痕癌與鱗癌之間生存素蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

圖1 生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌及正常對(duì)照皮膚中免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry of survivin in keloid,skin scar carcinoma,squaumous cell carcinoma lesions and normal control skins

表1 生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、皮膚鱗癌中的表達(dá)與性別、年齡、原發(fā)病、臨床病理特征及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Tab.1 Correlation analysis between gender,age,primary diseases,clinical pathological staging,lymph node metastasis and survivin expression in keloid,skin scar carcinoma,squaumous cell carcinoma lesions

2.2 生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、皮膚鱗癌中的表達(dá)與性別、年齡、原發(fā)病及臨床病理特征的關(guān)系 生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中的表達(dá)與性別、年齡均無(wú)關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌中的表達(dá)與原發(fā)病無(wú)關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌與皮膚鱗癌中的表達(dá)與組織病理分級(jí)無(wú)明顯關(guān)系,與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(表1)。

3 討論

細(xì)胞的凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、臨床治療有密切的關(guān)系,是腫瘤生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因素之一[9]。生存素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子,抑制細(xì)胞的程序化死亡,導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。生存素在胚胎發(fā)育期間表達(dá),終末分化組織中不表達(dá),但在很多的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá),在癌旁組織中不表達(dá)。生存素抗細(xì)胞凋亡作用的可能機(jī)制有:(1)通過(guò)與凋亡蛋白酶終末分子caspase-3和caspase-7結(jié)合,從而發(fā)揮抗凋亡作用;(2)其螺旋結(jié)構(gòu)與有絲分裂微管結(jié)合,通過(guò)抑制caspase-9導(dǎo)致抑制caspase系統(tǒng),從而抑制caspase引起的細(xì)胞凋亡;(3)通過(guò)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4形成復(fù)合體,使p21從CDK4復(fù)合體中釋放并與線粒體中的procaspase-3結(jié)合,從而抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10-12]。

本免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,生存素在正常皮膚組織中不表達(dá);生存素在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌及鱗癌中表達(dá)均較高,表達(dá)陽(yáng)性率分別為31.71%、54.29%、60.87%;皮膚瘢痕癌與鱗癌的生存素蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于瘢痕疙瘩(P值均＜0.05),而皮膚瘢痕癌與鱗癌之間生存素蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。上述結(jié)果表明,正常皮膚損傷后,成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中不僅發(fā)生量的變化,更重要的是發(fā)生了質(zhì)的變化—生存素的高表達(dá),過(guò)度表達(dá)的生存素導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的凋亡機(jī)制存在異常,這可能與瘢痕疙瘩持續(xù)生長(zhǎng)、易侵襲、復(fù)發(fā)及導(dǎo)致瘢痕癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。生存素的高表達(dá)亦可能是皮膚瘢痕癌及鱗癌發(fā)生的重要因素之一。

本研究發(fā)現(xiàn),生存素蛋白在瘢痕疙瘩、皮膚瘢痕癌、鱗癌中的表達(dá)與性別、年齡均無(wú)關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌中的表達(dá)與原發(fā)病無(wú)關(guān);生存素蛋白在皮膚瘢痕癌及皮膚鱗癌中的表達(dá)與組織病理分級(jí)無(wú)關(guān),與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);皮膚瘢痕癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組生存素陽(yáng)性率分別為78.6%、38.1%;皮膚鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組生存素陽(yáng)性率分別為84.2%、44.4%;二者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05),表明生存素的表達(dá)可能與皮膚瘢痕癌及皮膚鱗癌的某些生物學(xué)特性有關(guān),如發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等腫瘤的惡性行為[13]。

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