環氧化酶-1在坐骨神經冷凍致神經病理性疼痛模型大鼠脊髓的表達

韓彬彬,馮藝

神經冷凍術(cryoanalgesia)是一種簡便易行且有效的鎮痛方法,目前仍被廣泛用于臨床治療急性疼痛(如術后鎮痛)和慢性疼痛。但有研究表明,神經冷凍會產生慢性神經病理性疼痛(neuropathic pain,NP),限制了它的推廣[1-3]。我們的一項前瞻性隨機對照研究表明,肋間神經冷凍鎮痛增加術后痛覺過敏的程度,增加觸誘發痛的發生率[4]。神經冷凍鎮痛可能導致神經病理性疼痛這一現象已經引起臨床醫師們的關注,但發病機制目前尚不清楚。1994年Deleo等成功建立大鼠坐骨神經冷凍(sciatic cryoneurolysis,SCN)致神NP模型[5],為后來的試驗研究提供了條件。環氧化酶(COX)是前列腺素合成的重要限速酶,它有兩種主要存在形式:COX-1和COX-2,有研究發現在NP模型動物脊髓中環氧化酶表達上調,推測它對NP中樞敏化有重要作用。本研究旨在通過建立大鼠SCN致NP模型,動態觀察大鼠疼痛行為學變化和脊髓水平的COX-1的表達,進一步探討外周神經冷凍致NP的發病機制及環氧化酶在其中的作用,為完善冷凍鎮痛技術,指導未來臨床預防和治療在神經冷凍治療疼痛過程中引發的慢性疼痛提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 模型制備[5]72只健康SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供),體重180～200 g,于北京大學人民醫院實驗動物中心(SPF級)預檢3 d,動物飼養室有良好的通風和空氣過濾系統,室溫維持在23℃左右,濕度55%左右,自由攝食水。大鼠經水合氯醛(北京大學人民醫院配制)按300 mg/kg腹腔注射麻醉后,在大鼠右側下肢外側局部皮膚備皮、消毒,在股骨大轉子至膝關節沿線切皮約1.5 cm,從股二頭肌間隙鈍性分離出坐骨神經主干,使用絲線將距離分支前2 mm的坐骨神經主干略微提起但不超過皮面,用直徑為1.8 mm的冷凍探頭(北京庫蘭醫療設備有限公司,使用CO2作為低溫氣源,冷凍溫度達-50℃)冷凍60 s。冷凍操作后,用0號絲線逐層縫合肌筋膜、淺筋膜和皮膚。整個過程持續約10 min。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分為3組:正常對照組(N組,n=6),假手術組(S組,n=33)和冷凍手術組(C組,n=33)。假手術組暴露坐骨神經后,僅用絲線將坐骨神經提起,使牽拉程度與冷凍手術組相同,持續60 s,不作冷凍操作,其余均同冷凍手術組。正常對照組未予任何處理。

1.3 疼痛行為學觀察和評分 在制模前及制模后1、2和4周測量體重,測定機械痛閾,記錄自噬評分,并觀察大鼠下肢在安靜和行走時是否正常。所有測定均在固定時間和安靜的環境下進行。

機械痛閾的測定:將大鼠置于相互隔開的透明有機玻璃容器內,預適應15 min,采用8根不同質量(1 g 、2 g 、4 g 、6 g 、8 g 、15 g 、26 g 、60 g)的 Von Frey hairs纖維絲(Stoeling Co.,Wood Dale,IL,USA)垂直刺激后足底部,彎曲至90°,持續6～8 s,大鼠在刺激時或之后即刻出現抬后足,延遲放落,抖動,舔食該足等均認為陽性,最后應用Dixon報道的 up and down方法[6]推算出大鼠50%機械縮足閾。

如果痛閾較制模前下降≥2個級別(相鄰2根纖維絲的質量范圍為1個級別),認為出現了痛覺過敏。

采用Wall報道的方法進行自噬評分[7]:當后爪有血跡或皮膚破損記1分,另外任何一個腳趾的近段或遠端被咬破時再記1分,最高為11分。

1.4 免疫組織化學染色 各時間點C組、S組各取6只大鼠腰膨大脊髓,采用免疫組化方法檢測COX-1的表達。大鼠在麻醉后(同前),開胸經左心室插管進入主動脈根部,剪開右心耳,灌注4℃生理鹽水200 ml沖盡血液,然后采用4%多聚甲醛200 ml灌注固定1 h。取腰膨大脊髓,浸入4%多聚甲醛后固定6 h,20%蔗糖脫水24 h,保存于4℃30%蔗糖中。取脊髓節段,在冷凍切片機中進行冠狀面冰凍切片,片厚 10 μ m。3%H2O2孵育10 min;羊血清室溫孵育 10 min;滴加按 1∶200稀釋的兔抗 COX-1抗體(Cayman,MI,USA),4℃過夜;滴加羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫孵育20 min,DAB顯色,蘇木素復染。陰性對照以PBS代替一抗,余步驟相同。于光學顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察,以細胞核內出現棕黃色顆粒為COX-1免疫組化染色陽性。在脊髓背角淺層,于400×高倍鏡下隨機選取3個視野,應用Leica圖像分析軟件分析每個視野平均灰度值和陽性面積,以兩者的乘積的平均值代表每只大鼠脊髓COX-1表達強弱。

1.5 統計學處理 所有數據采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計分析,計量數據以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組內比較采用配對t檢驗,計數資料采用χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經病理性疼痛模型的建立 大鼠SCN后患側下肢運動障礙,表現為特異行為:蘇醒后患肢足背著地屈指保護位,腳掌不能著地行走,輕微水腫,隨后患肢較對側萎縮變細,2周時逐漸恢復正常形態和運動功能,幾乎接近正常。C組和S組大鼠體重增長與N組無顯著性差異。見表1。

術后1周患側機械性縮足閾明顯升高,高于基礎值和其他兩組,2周時降至基礎水平,4周時再下降,低于基礎值和正常對照組;術后1周、2周和4周對側下肢機械性縮足閾均低于基礎值和正常對照組。S組雙側下肢機械性縮足閾術后1周、2周和4周均下降低于基礎值,而且對側低于正常對照組。見表2。

C組術后2周及4周痛覺過敏發生率為48%和38%,高于S組33%和19%,但差異無統計學意義,患側和對側痛覺過敏發生率無顯著性差異。見表3。

自噬后足現象僅發生在C組,自噬評分高于S組。見表4。

術后1周發生率為40%,2周時新增3.8%,4周時新增5%。

2.2 脊髓COX-1蛋白表達 冷凍后2周和4周冷凍手術組脊髓背角淺層COX-1表達上調,高于S組,且雙側脊髓COX-1表達無差異。見表5。

形態上觀察,表達COX-1的細胞主要為灰質內神經元細胞和少量散在分布于白質內的大個細胞,經免疫熒光共染證實分別為神經元和小膠質細胞。脊髓背角神經元胞體小,數量多,呈游魚樣分布,腹角內神經元胞體大,數量少,神經元細胞核表達為主,可見核內密集的陽性顆粒;而在白質膠質細胞胞漿內有明顯的COX-1表達。

表1 正常對照組、S組和 C組大鼠體重較基礎值增長的比較

表2 N組,S組和C組術后各時間點大鼠雙側下肢50%機械縮足閾(g)

表3 S組和C組術后大鼠痛覺過敏發生率的比較[n(%)]

表4 S組和C組術后大鼠雙側后足自噬評分比較

表5 S組和C組術后腰段脊髓背角淺層COX-1表達強弱比較(n=6)

3 討論

大鼠坐骨神經冷凍是研究人類外周神經冷凍鎮痛致NP的良好動物模型。Deleo等 1994年的研究顯示,大鼠SCN后雙側下肢在術后2至3周開始出現觸誘發痛,持續到術后10周[8]。這與我們的研究結果一致。大鼠冷凍側下肢先麻痹,2周時縮足閾和運動功能恢復到術前水平,4周出現痛覺過敏,而對側1周時開始出現痛覺過敏直到實驗結束,一側SCN致雙側下肢發生觸誘發痛這種鏡像現象提示我們中樞神經系統敏化或去抑制可能參與NP的形成,另外痛覺過敏延遲發生也進一步證明外周神經局部損傷后,可能局部產生炎性介質或神經遞質逆行轉運至中樞,引起中樞敏化或去抑制這一過程,中樞重塑是觸誘發痛延遲出現并持續數周的基礎。Deleo等1999年的研究發現,大鼠脊神經冷凍后7 d,雙側脊髓膠質細胞激活,表明冷凍確實引起中樞重塑,進而中樞敏化,產生持久的觸誘發痛[9]。

大鼠自噬后足的行為是NP的特點,外周神經切斷和慢性壓迫均產生自噬現象。Wall等認為完全性切斷神經自噬率最高[7],Selter和Kim等的研究中脊神經結扎和坐骨神經部分結扎模型沒有自噬行為發生[10-11]。本研究中自噬僅發生在冷凍側后足,術后1周發生率高達 40%,低于 Deleo等的研究結果76%[1]。自噬的相關機制還不清楚。Deleo等1995年研究大鼠坐骨神經冷凍后局部神經的病理學表現,發現冷凍后1周,巨噬細胞浸潤最多,神經纖維Wallerian變性最嚴重,小纖維開始再生,自噬發生與纖維再生和炎性細胞浸潤相關[12]。可以推測外周神經損傷后,在修復過程中再生纖維異常放電或炎性介質逆傳至中樞,興奮中樞,引起患肢感覺異常而出現自噬現象。這可以解釋自噬為什么不是在冷凍后很快發生,而往往在三四天后開始出現,術后一二周自噬最嚴重,這正是感覺和運動功能開始恢復的時間。

COX-2在炎性疼痛、癌性疼痛和神經病理性疼痛的發生和維持中起重要作用。很多研究已證明COX-1和COX-2在脊髓中均有基礎表達,而且多種神經病理性疼痛模型中以及臨床實踐中給予COX-2抑制劑不能緩解疼痛。這可能是COX-1在脊髓表達上調從而發揮作用。通過對基因敲除小鼠的研究表明,在疼痛中發揮作用的環氧化酶是COX-1,而不是COX-2。在手術切口和外周神經損傷后,脊髓COX-1表達上調,給予COX-1抑制劑能劑量依賴性減輕觸誘發痛[13-15]。本預試驗表明,大鼠坐骨神經冷凍后脊髓COX-2表達無明顯改變,而COX-1表達上調了。采用免疫組化的方法確定脊髓中COX-1的表達,冷凍后2周和4周雙側脊髓背角淺層COX-1表達上調。這與雙側觸誘發痛的時間一致。因此,脊髓COX-1表達參與大鼠SCN后NP的維持。Zhang在大鼠炎性疼痛模型中發現,脊髓小膠質細胞增殖活化,表達COX-1增加[16];Deleo在坐骨神經冷凍模型中也發現膠質細胞增殖活化,以星形膠質細胞更明顯[9]。本研究顯示,從細胞形態學上看脊髓中的COX-1主要由灰質神經元和白質小形膠質細胞表達。這與Deleo的研究結果一致,即坐骨神經冷凍后脊髓小形膠質細胞增殖活化,表達COX-1增加。

綜上所述,大鼠SCN模型成功地模擬了臨床中外周神經冷凍先鎮痛后致痛這一病理過程,為NP的發病機制和治療的研究提供了理論基礎。COX-1在冷凍致NP的維持中起重要作用,提示非選擇性環氧化酶抑制劑或選擇性COX-1抑制劑可能對緩解冷凍后NP有作用。

[1]Callesen T,Bech K,Thorup J,et al.Cryoanalgesia:effect on postherniorrhaphy pain[J].Anesth Analg,1998,87(4):896-899.

[2]Muller L C,Salzer G M,Ransmayr G,et al.Intraoperative cryoanalgesia for postthoracotomy pain relief[J].Ann Thorac Surg,1989,48(1):15-18.

[3]Conacher ID,Locke T,Hilton C.Neuralgia after cryoanalgesia for thoracotomy[J].Lancet,1986,1(8475):277.

[4]Ju H,Feng Y,Yang BX,et al.Comparison of epidural analgesia and intercostal nerve cryoanalgesia for post-thoracotomy pain control[J].Eur JPain,2008,12:378-384.

[5]Deleo JA,Coombs DW,Willenbring S,et al.Characterization of a neuropathic pain model:sciatic cryoneurolysis in the rat[J].Pain,1994,56:9-16.

[6]Chaplan SR,Bach FW,Pogrel JW,et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].JNeurosci Methods,1994,53:55-63.

[7]Wall PD,Devor M,Inbal R,et al.Autotomy following peripheral nerve lesions:experimental anaesthesia dolorosa[J].Pain,1979,7(2):103-111.

[8]Willenbring S,Deleo AJ,Coombs DW,et al.Differental behavioral outcomes in the sciatic cryoneurolysis model of neuropathic pain in rats[J].Pain,1994,58:135-140.

[9]Colburn RW,Rickman AJ,DeLeo JA,et al.The effect of site and type of nerve injury on spinal glial activation and neuropathic pain behavior[J].Exp Neurol,1999,157:289-304.

[10]Kim SH,Chung JM.An experimental modal for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat[J].Pain,1992,50:355-363.

[11]Shelter Z,Dubner R,Shir Y,et al.A novel behavioral modal of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injur[J].Pain,1990,43:205-218.

[12]Wagner R,DeLeo JA,Heckman HM,et al.Peripheral nerve pathology following sciatic cryoneurolysis:relationship to neuropathic behaviors in the rat[J].Exp Neurol,1995,133:256-264.

[13]Zhu X,Conklin D,Eisenach JC,et al.Cyclooxygenase-1 in the spinal cord plays an important role in post-operative pain[J].Pain,2003,104:15-23.

[14]Kroin JS,Takatori M,Li J,et al.Upregulation of dorsal horn microglial cyclooxygenase-1 and neuronal cyclooxygenase-2 after thoracic deepmuscle incisions in the rat[J].Anesth Analg,2008,106(4):1288-1295.

[15]Zhu X,Eisenach JC.Cyclooxygenase-1 in the spinal cord is altered after peripheral nerve injury[J].Anesthesiology,2003,99:1175-1179.

[16]Zhang FY,Wan Y,Zhang ZK,et al.Peripheral formalin injection induces long-lasting increases in cyclooxygenase-1 expression by microglia in the spinal cord[J].JPain,2007,8(2):110-117.