細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切圖譜分析

魏榮旋,趙 慶,王 和

(1.遵義醫學院附屬三院 檢驗中心,貴州 遵義 563002;2.貴陽醫學院微生物教研室,貴州 貴陽 550004)

細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切圖譜分析

魏榮旋1*,趙 慶1,王 和2

(1.遵義醫學院附屬三院 檢驗中心,貴州 遵義 563002;2.貴陽醫學院微生物教研室,貴州 貴陽 550004)

目的探討細胞壁缺陷對淋病奈瑟菌隱蔽性質粒B(cppB)基因的影響以及細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB的變異特點。方法用青霉素誘導淋病奈瑟菌成為細胞壁缺陷型并獲得其純培養物,cppB基因特異性引物PCR檢測細胞壁缺陷型純培養物的cppB基因,并對其cppB基因PCR擴增產物進行限制性核酸內切酶圖譜分析。結果細菌型和細胞壁缺陷型均具有 cppB基因擴增產物,經過限制性內切酶HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ消化和電泳,在 5%PAGE凝膠電泳中,呈現出相同的電泳條帶。結論淋病奈瑟菌細菌型及其細胞壁缺陷型對cppB基因限制性核酸內切酶(HindⅢ、HinfⅠ、MspⅠ、HpaⅡ)的分析沒有發現淋病奈瑟菌L型具有與其親代細菌型不同的圖譜,提示細胞壁缺陷沒有導致淋病奈瑟菌的cppB基因發生這些核酸酶切位點中核苷酸序列的改變。

細胞壁缺陷型;淋病奈瑟菌;cppB基因;酶切

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1353)

細胞壁缺陷型(又稱細菌L型)是細菌最常發生的變異類型,它不僅導致細菌的形態發生改變[1,2,3],同時也常常導致細菌的生長繁殖、代謝活性、致病性、抗原性、抗生素敏感性、遺傳等方面特性的發生改變[4,5,6]。淋病奈瑟菌96%以上的菌株攜帶隱蔽性質粒B(cppB)基因,即使在不含cppB的菌株的染色體也整合有攜帶隱蔽性質粒B[3,6,7]。由于臨床治療淋病奈瑟菌的感染廣泛采用青霉素或β-內酰類等抗生素進行治療,發生細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的情況不可避免,用常規培養的方法難以檢測到病原菌,常常導致漏診或誤診。國際上常使用PCR檢測病員的分泌物或培養物cppB基因來鑒定淋病耐瑟菌或診斷淋病。也有文獻報道[3,9]細胞壁缺陷型細菌可發生攜帶的質粒的丟失,甚至染色體基因序列也可以發生改變。為了進一步探討細胞壁缺陷對淋病奈瑟菌cppB基因的影響、了解其變異的特點,我們對淋病奈瑟菌L型(青霉素誘導形成)的cppB基因進行PCR檢測、并對產物進行酶切分析,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 淋病奈瑟菌標準株(29106-6),北京中國藥品和生物制品鑒定所提供。

1.1.2 非高滲培養基 肝消化液,按文獻方法[4,5]制備。

1.1.3 誘導劑 青霉素G鈉注射液(批號

B20090525),由哈爾濱制藥總廠提供。

1.1.4 cppB PCR試劑盒 引物的堿基序列為:5,-CTTGGCTGGTTGATTCAAG-3,, 5,-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3,,由華美生物工程公司提供。

1.1.5 限制性內切酶 HindⅢ切割位點:5,…A↓AGCTT…3,,HinfⅠ切割位點:5,…G↓ATTC…3,,HpaⅡ切割位點:5,…C↓CGG…3,,MspⅠ切割位點:5,…C↓CGG …3,,由華美生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 L型誘導 將淋病奈瑟菌接種于含5 ml肝消化液培養基的小方瓶內,加入青霉素使其終濃度為15 u/ml。用膠塞蓋緊瓶口置普通溫培養箱內37℃培養,在倒置顯微鏡高倍鏡下逐日觀察細菌型及L型的生長情況。L型形成后取培養物經0.22 μ m孔徑濾菌器過濾并接種0.5 ml濾過物于不含誘導劑的5 ml肝消化液培養基內,每5-7天傳一代培養獲得L型純培養物。每次傳代分別收集L型培養物,置-20℃冰箱內保藏備用。

1.2.2 細菌型培養 將淋病奈瑟菌接種于不含誘導劑的5 ml肝消化液培養基的小方瓶內,用膠塞蓋緊瓶口置普通溫培養箱內37℃培養。每天取細菌型培養物0.5 ml接種于不含誘導劑的5ml肝消化液培養基內傳代培養和收集培養物置-20℃冰箱內保藏備用。

1.2.3 cppB基因的PCR 根據淋病奈瑟菌PCR診斷試劑盒說明書推薦的程序進行。

1.2.4 cppB基因的酶切分析

1.2.4.1 淋病奈瑟菌細菌型和細胞壁缺陷型cppB基因PCR產物的純化 按文獻[5]提供的方法進行。

1.2.4.2 cppB基因(純化后)的DNA含量的測定在紫外分光光度計波長為260 nm和280 nm下分別測量其吸光度值,按文獻[8,9]提供的公式計算樣本的DNA含量。

1.2.4.3 限制性核酸內切酶處理 按試劑盒推薦的程序,分別用HindⅢ 、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ對純化后的細菌型和細胞壁缺陷型的cppB基因PCR擴增產物進行消化。反應體系為:

無菌去離子水 -10×Buffer 2μ l Acetylated BSA 2μ l DNA 底物 1μ g限制性內切酶 2-4 μ l總體積 20μ l

1.2.4.4 取消化過的細菌型和細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的cppB基因PCR產物5 μ l分別加入等量的載樣緩沖液,各樣品加于5%PAGE凝膠樣品孔內,以電壓1-8 V/每cm膠距電泳10小時,取出凝膠固定、銀染色、觀察結果并照相。

2 結果

2.1 淋病奈瑟菌cppB基因PCR結果 淋病奈瑟菌細菌型和細胞壁缺陷型(1-4代)樣品經PCR擴增和電泳后,能夠觀察到與試劑盒陽性對照一致的明顯的cppB基因條帶,但細胞壁缺陷型5代后培養物未能檢出陽性DNA條帶。

2.2 cppB基因PCR產物限制性核酸內切酶圖譜限制性核酸內切酶HindⅢ不能切開細菌型以及L型的cppB基因擴增片段,HpaⅡ酶將細菌型和L型的cppB基因擴增片段分別切開為相同的兩條帶(圖1)。HinfⅠ不能切開細菌型和L型的cppB基因擴增片段。MspⅠ酶切細菌型和L型可將兩型細菌的cppB基因擴增片段分別切開為相同的兩條帶(圖2)。

圖1 淋病奈瑟菌 HindⅢ和 HpaⅡ酶切圖譜

圖2 淋病奈瑟菌HinfⅠ和MspⅠ酶切圖譜

3 討論

利用分子生物學技術對分子結構進行分析,聚合酶鏈反應-單鏈構型多態性(PCR-SSCP)、限制性核酸內切酶等方法已廣泛用于核酸的組成及其同源性和特異性的研究[8,9]。限制性核酸內切酶具有從分子內部特異性切割核酸的作用,使用某種具有已知切割位點的限制性核酸內切酶對目的基因或核酸進行消化,通過對其產物的分子量、組成等分析可了解該基因或核酸的組成及其同源性。如果核酸的酶切位點發生改變,可以通過電泳技術觀察到不同的條帶,通常提示組成該基因或核酸的核苷酸序列發生了改變。

本文結果顯示淋病奈瑟菌穩定L型的cppB基因PCR擴增產物經四種核酸內切酶分別消化及5%的聚丙酰胺凝膠電泳技術觀察到與其親代細菌型相同的條帶,提示淋病奈瑟菌穩定L型暫時保留的cppB基因并沒有發生這些核酸酶切點中核苷酸序列的改變和仍然具有與其親代細菌型相同的核酸酶切點。結合文獻[10]資料,提示淋病奈瑟菌L型cppB基因的核苷酸序列可能發生微小的改變或點突變,但不是HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ這四個限制性核酸內酶切位點的改變。

因此可以推斷:淋病奈瑟菌L型細菌的變異不是簡單的形態學表型變異,而可能是涉及到1個至數個核苷酸的改變以及最終導致隱蔽性質粒cppB基因丟失[6,10]的遺傳型突變。

[1]GJ Domingue.Cell wall-deficient bacterial.[M].London:Addison Wesley publishing company,1982:409-420.

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[3]魏榮旋,王 和.細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因的檢測[J].中國微生態學雜志,2002,14(6):345.

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[5]聞玉梅,陸德源,何麗芳.現代醫學微生物[M].上海:上海醫科大學出版社,1999:71-817.

[6]魏榮旋,王和.cppB基因PCR檢測淋病奈瑟菌穩定L型的評價[J].貴州醫藥,2003,27(1):24.

[7]Cano R,Palomares JC.Evaluation of a DNA probe plasmid origin fordetection Neisseria gonorrhoeae in cultures and clinical spencimens[J].Mol Cell Probe,1991,5(1)1:49.

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[9]金冬雁,等編譯.分子克隆實驗指南[M].北京:科學出版社,1993.

[10]魏榮旋,王 和.聚合酶鏈反應-單鏈構型多態性檢測細胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因變異[J].中國微生態學雜志,2003,15(6):329.

Analysis of the Cryptic Plasmid B Gene of Cell Wall Deficient Neisseria gonorrhoeae by Restriction Enzyme Map

WEI Rong-xuan1*,ZHAOQing1,WANG He2.(1.The Laboratory Center,the3rd Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi563002,China;2.TheDepartment of Mic robiology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)

Objective To probe influence of cellwall deficiency on the Cryptic PlasmidB gene of N.gonorrhoeae andits characteristic variation.MethodsThe N.gonorrhoeae was induced into L-form by penicillin and the cppB gene of the pure culture of L-form was determined by PCR and Restriction Enzyme(HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠ ,HpaⅡ).ResultsBy PCR,the cppB geneswere be found inboth the bacterial form and the L-forms of N.gonorrhoeae.There were same bands in the bacterial form and the L-forms by Restriction Enzyme Map.ConclusionThe Restriction Enzyme Mapswere not different in the bacterial form and the L-forms.These were shown that base alignment of cell wall deficiency on the Cryptic Plasmid B would not change by Restriction Enzyme of HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠand HpaⅡ.

L-form;N.gonorrhoeae;cppB gene;Restriction Enzyme Map

R372

A

1007-4287(2010)09-1353-03

*通訊作者

book=1354,ebook=415

2010-06-21)