陰溝腸桿菌的Ⅰ類整合子檢測及相關耐藥基因分析

李 巖,蘇建榮,許淑珍,劉志遠

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心,北京 100050)

陰溝腸桿菌的Ⅰ類整合子檢測及相關耐藥基因分析

李 巖,蘇建榮,許淑珍,劉志遠

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心,北京 100050)

目的對臨床分離的陰溝腸桿菌進行Ⅰ類整合子及相關耐藥基因分析,探討I類整合子與陰溝腸桿菌耐藥播散的關系。方法使用Vitek-AMS鑒定細菌;采用PCR擴增技術對86株陰溝腸桿菌進行Ⅰ類整合子與ESBLs耐藥基因型檢測;Ⅰ類整合子與耐藥基因水平傳播采用質粒接合試驗;根據CLSI指南進行藥敏試驗。結果86株陰溝腸桿菌中,77.9%的陰溝腸桿菌攜帶不同大小的整合子,從1 500 bp整合子中檢出的耐藥基因盒包括:aadB、aadA2;2 500 bp整合子中檢出PSE-1、aac6-Ⅱ、aadA4基因盒。結論陰溝腸桿菌中常攜帶含有多種耐藥基因的Ⅰ類整合子,Ⅰ類整合子常參與耐藥基因在菌株間進行的水平傳遞。

陰溝腸桿菌;Ⅰ類整合子;耐藥

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1356)

整合子是近年來發現的一種天然的表達和克隆載體,具有強大的基因捕獲、移動和表達能力,目前已有4類整合子得到了確定。而在大多數臨床分離株及革蘭陰性桿菌中存在著1類整合子。本文對臨床分離的陰溝腸桿菌攜帶的Ⅰ類整合子及相關耐藥基因進行分析,以期探討Ⅰ類整合子與耐藥基因在陰溝腸桿菌菌株間的播散特點與機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取2006年1月至2006年10月間,我院住院患者痰、尿、傷口引流物等標本中分離的陰溝腸桿菌86株。全部菌株均通過Vitek-AMS鑒定。

質控菌株 大腸埃希菌ATCC25922,銅綠假單孢菌ATCC27853,肺炎克雷白菌ATCC 700603(產SHV-18)。經PCR擴增與DNA測序證實的攜帶有TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-9 基因以及 Ⅰ類整合子的陰溝腸桿菌,作為聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)的陽性參考菌株,陰溝腸桿菌029作為PCR反應的陰性參考菌株。

質粒接合試驗菌株 供體菌(donor)為攜帶ESBLs耐藥基因的陰溝腸桿菌。受體菌(recipient)為大腸埃希菌ECO-600(萘啶酸耐藥NAlR,利福平耐藥RifR,不攜帶質粒F-,不發酵乳糖lac-)。

1.2 抗菌藥物與藥敏紙片 抗菌藥物包括,頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、環丙沙星(CIP)、氨曲南(ATM)、利福平(Rif)購自中國生物制品研究所。左旋氧氟沙星(LVX)購自北京雙鶴藥業股份有限公司。

1.3 培養基 羊血瓊脂平板購自天津金章公司。M-H瓊脂為英國Oxoid公司產品。質粒接合試驗選擇性培養基,參閱文獻[1]。

1.4 藥敏試驗 瓊脂稀釋法(MIC法),按照CLSI指南進行操作和判讀結果。

1.5 PCR試劑 引物合成,PCR試劑和DNA分子量標準,均由北京賽百盛公司提供。

1.6 ESBLs耐藥基因檢測

PCR引物設計、反應體系與條件參閱文獻[1]。

1.7 Ⅰ類整合子相關耐藥基因盒擴增

根據Ⅰ類整合子可變區兩側的高度保守序列設計引物[2],(in-F 5′-GGCATCCAAGCAG CAAG-3′和 in-B 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′)進行 Ⅰ型整合子可變區PCR擴增。

PCR擴增條件:反應體系為50 μ l,含有10×PCR反應 buffer,200 μ MdNTPs,引物各 10 μ M,1 UTaqDNA聚合酶。整合子擴增條件為:95℃變性10',然后95℃1'→55℃2'30”→72℃1',30個循環,最后 72℃延伸10'。

1.8 PCR擴增產物鑒定與序列分析 參閱文獻。

1.9 質粒接合試驗 參閱文獻[1]。

2 結果

2.1 Ⅰ型整合子PCR擴增結果

對86株陰溝腸桿菌進行Ⅰ類整合子可變區基因擴增,發現多種不同長度的整合子可共同存在于陰溝腸桿菌中,擴增片斷大小從150 bp到2 500 bp不等。86株細菌中整合子PCR擴增陽性67株,占77.9%。其中42株ESBLs多重耐藥菌株:整合子擴增陽性率占88.1%(37/42);主條帶＞1 000 bp者76.2%(32/42)。44株非ESBLs菌株(含AmpC酶陽性菌株)整合子擴增陽率占52.3%(23/44)。主條帶出現在 ＞1 000 bp者11.3%(5/44)。

2.2 ESBLs陽性菌株與其接合子中整合子PCR擴增產物電泳譜特點

對6株接合試驗陽性接合子進行了整合子擴增,并與供體菌的整合子電泳圖譜進行比較,其中4株供體菌(12號、28號、48號、34號)在接合試驗中,將其整合子轉入受體菌。而2號菌株為ESBLs陽性菌株(接合實驗未成功),其含有大小約150 bp、300 bp、2 500 bp的整合子擴增片斷。

圖1 部分ESBLs陽性菌株與其接合子中整合子PCR擴增產物電泳譜

2.3 整合子擴增產物序列分析

選取不同大小的PCR產物,進行純化后克隆測序 。其中,約2 500 bp、1 500 bp、450 bp 大小的PCR擴增片斷測序成功。450 bp整合子結構中插入基因盒為mobB;1 500 bp整合子結構中插入基因盒為aadB,aadA2;2 500 bp整合子結構中插入基因盒為aacA4,aac6-II,PSE-1。

3 討論

細菌耐藥性的迅速蔓延及擴散,給臨床感染性疾病的治療帶來了極大的副作用。在耐藥基因擴散的機制中,耐藥性質粒及轉座子在其中起著重要的作用。近年來,第三種耐藥基因的擴散機制已被發現,即整合子(integron),一種通過特異重組位點介導耐藥基因整合的DNA元件。其中,Ⅰ類整合子的結構最為完整,由5'和3'保守端及中間的可變區組成。在可變區中可含有插入基因,而插入的基因包含著被叫做基因盒(gene cassette)的可移動元件,大多數都表達耐藥性。迄今為止,至少70種不同的耐藥基因盒已被發現,它們在種內及種間轉移,使宿主菌成為廣譜耐藥性細菌。

對我院分離的陰溝腸桿菌整合子檢測發現,Ⅰ類整合子PCR擴增陽性77.9%。ESBLs菌株Ⅰ類整合子擴增陽性率88.1%,主條帶 ＞1 000 bp者占76.2%。非ESBLs菌株Ⅰ類整合子擴增陽性率占52.3%,11.3%主條帶 ＞1 000 bp。這說明,Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌中普遍存在,并可以多克隆形式存在,而在產ESBLs菌株中,其整合子內的插入基因可能更為復雜。整合子的存在無疑是陰溝腸桿菌可以不斷攝取新基因并進行水平播散的重要條件基礎。

通過對整合子可變區序列分析發現,不同長度的整合子擴增片段所含有的耐藥基因盒有所不同。450 bp長度的整合子中含有mobB。1 500 bp整合子中含有aadB,aadA2兩種基因盒。2 500 bp整合子中含有PSE-1,aac6-Ⅱ,aadA4基因盒。

其中 aadB 、aadA2、aac6-II、與aacA4基因盒為耐氨基糖苷類抗生素的相關耐藥基因。而PSE-1基因則為β-內酰胺類耐藥基因,其編碼PSE-1蛋白,可造成細菌對氨芐西林、羧芐西林、頭孢噻酚、頭孢孟多和派拉西林的耐藥。可見,Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌β-內酰胺類耐藥機制中也扮演了重要角色。在陰溝腸桿菌攜帶的Ⅰ類整合子中檢出β-內酰胺類耐藥基因在國內未見相關報道。

耐藥性的產生主要是通過自身基因的突變積累,或者在水平方向上獲取耐藥性基因。整合子被認為是耐藥基因水平傳播的重要因子。整合子本身無法進行轉移,他們常常出現在轉座子及接合性質粒上,而這些轉座子又常常位于質粒上,這種情況提高了耐藥基因盒擴散的能力[3,4]。本研究也表明,Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌相關耐藥基因的播散中發揮了重要作用。

[1]李 巖,許淑珍,蘇建榮,等.陰溝腸桿菌喹諾酮耐藥基因的檢測[J].中華醫院感染學雜志 2008,18(4):474.

[2]Papanicolaou G A,Medeiros A A,Jacoby G A,et al.Novel plasmidmediated β-lactamase(MIR-1)conferring resistance to oxyimino-and αmethoxy β-lactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Antimicrob.Agents Chemother,1990,34:2200.

[3]Ceccarelli D,Salvia A M,Sami J,et al.New cluster of plasmid-located class I integrons in Vibrio cholerae O1 and a dfrA 15 cassette-containing integron inVibrio parahaemolyticus isolated in Angola[J].Antimicrob A-gents Chemother,2006,50(7):2493.

[4]Dubois V,Poirel L,Marie C,et al.Molecular characterization of a novel class 1 integron containing bla(GES-1)and a fused product of aac3-Ib/aac6'-Ib'gene cassettes in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob A-gents Chemother,2002,46(3):638.

Analysis of drug restance genes in tegrated by classⅠintegron in clinical Enterobacter cloacae isolates

LI Yan,SU Jianrong,XUShu-zheng,et al.(Clinical laboratory center,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100050,China)

ObjectiveTo study distribution of the classⅠintergron in clinical Enterobacter cloacae isolates.MethodsE.cloacaewas identified by Vitek-AMS;Detection of class Ⅰ intergron and Extended-spectrumβ-lactamases(ESBLs)resistant genes were performedby PCR.Plasmid conjugation testwas used to determine the transmission of classⅠintergron.The antibotic susceptibility of Enterobacter cloacae was detected according to the CLSI guideline.ResultsThe incident rate of Enterobacter cloacae with classⅠintergronwas77.9%in 86strains.Sequencing data of integrons revealed that amplicon 1500bp harboredgenesof addB and aadA2,amplicon 2 500 bp harbored genes of PSE-1、,aac6-II、,aadA4.ConclusionEmergence of class Ⅰ integrons are frequent in E.cloacae,which usually harbor several different drug-resistant gene casettes.Drug restance genes in tegrated by classⅠintegron were widespread in clinical Enterobacter cloacae isolates.

Enterobacter cloacae;classⅠintergron;Drug resistance

R372

A

1007-4287(2010)09-1356-03

2009-12-20)