介導人α-反義寡核苷酸慢病毒載體的構建

賴穎暉,賴永榕,楊高暉

(廣西醫科大學第一附屬醫院血液科,廣西南寧 530021)

介導人α-反義寡核苷酸慢病毒載體的構建

賴穎暉,賴永榕*,楊高暉

(廣西醫科大學第一附屬醫院血液科,廣西南寧 530021)

目的構建介導人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體,為α-反義寡核苷酸對β-地中海貧血基因治療的體內試驗提供穩定的轉染細胞載體。方法根據人α-反義寡核苷酸序列設計siRNA、合成DNA片段,通過雙限制性內切酶消化和連接的方法構建pGCSIL-vshR NA-GFP載體質粒,接著該質粒轉化感受態的大腸桿菌E.coliDH5α,通過PCR及基因測序鑒定陽性克隆,再經Lipofectamine 2000將pGCSIL-vshRNA-GFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三質粒系統共轉染293 T細胞包裝病毒,通過綠色熒光蛋白的表達測定收集的病毒滴度。結果重組質粒的外源基因PCR鑒定正確,基因測序結果與所需要的α-反義寡核苷酸序列完全一致,濃縮后病毒滴度為5×109TU/ml。結論成功構建介導人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體。

慢病毒載體;反義寡核苷酸;基因治療

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1358)

β-地中海貧血是一種對人類健康危害嚴重的遺 傳性溶血性疾病。對重型β-地中海貧血,臨床上缺乏有效的治療手段,病人依賴于長期輸血及去鐵治療來維持生命,費用巨大,死亡率極高[1]。造血干細胞移植是唯一的根治方法,但是由于合適供體來源

受限及費用昂貴,臨床上難以廣泛開展。基因治療成為了β-地中海貧血治療的希望。劉容容等[2]的研究所篩選出的反義寡核苷酸(ASON)能高效抑制人α-珠蛋白基因表達,并能有效地抑制體外培養的重型β-地中海貧血紅系細胞α-珠蛋白基因表達,從而改善α/β+γ珠蛋白基因的比例失衡。本研究構建介導上述人α-ASON的慢病毒載體,并包裝純化慢病毒顆粒,為后續的α-ASON對β地中海貧血基因治療的體內試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 病毒載體(pGC-LV重組載體,pHelper 1.0,pHelper 2.0)(上海吉凱基因技術有限公司);293T(上海吉凱基因技術有限公司);Age I和EcoRI(NEB);250bp DNA ladder Marker(捷瑞);Lipofectamine 2000(Invitrogen)。凝膠成像儀(天能公司),細菌搖床(華利達實驗設備公司),細菌培養箱(上海一恒科學儀器有限公司),PCR儀(Applied Biosystems),熒光顯微鏡(奧林帕斯 micropublisher 3.3RTV),CO2培養箱(SANYO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 siRNA設計 根據劉容容等[3]篩選出的靶向人α-珠蛋白基因mRNA翻譯起始區、能高效抑制α-珠蛋白基因表達的ASON 序列(5′-CAGCACCATGGTGGGTTCTC-3′),設計 siRNA 序列 為 CAGCACCATGGTGGGTTCTC。病毒載體構建框架見表1。

表1 病毒載體構建框架

1.2.2 合成DNA片段 合成片段信息:

PSCSI1907-1 CcggCAGCACCATGGTGGGTTCTCTTCAAGAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTTTTTg;PSCSI-1907-2 aattcaaaaaCAGCACCATGGTGGGTTCTCTCTCTTG AAGAGAACCCACCATGGTGCTG

委托上海吉凱基因技術有限公司合成引物。引物退火。

1.2.3 將α-ASON序列連接入慢病毒載體 Age I和EcoRI酶切pGCSIL-GFP載體以使其線性化。連接反應體系見表2。于16℃連接過夜。

表2 連接反應體系

1.2.4 轉化 用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞,從每種感受態細胞懸液中各取200 μ l轉移到無菌的微量離心管中,每管加2 μ l連接液,混勻,在冰中放置30 min。將管放到42℃水浴中90 s,再快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1-2 min。每管加800 μ l SOC培養基。用水浴將培養基加溫至37℃,然后將管轉移到37℃搖床上,溫育 45 min使細菌復蘇。將150 μ l已轉化的感受態細胞轉移到含20 mmol/L MgSO4和 Amp 抗性(100 μ g/ml)的 LB 瓊脂培養基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿,于37℃培養,16 h。

1.2.5 陽性克隆的鑒定

(1)陽性克隆的PCR鑒定PCR引物序列:Primer(+):5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′,Primer:5′-GTAATACGGTTATCCACGCG-3′;PCR 反應體系 :10×buffer 2 μ l,dNTPs(2.5 mM)0.8 μ l,Primer(+)0.4 μ l,Primer(-)0.4 μ l,Taq polymerase 0.2 μ l,Template 1 μ l,ddH2O 補足 20 μ l;PCR 反應條件 :94℃,30 sec;94℃、30 sec,55℃、30 sec,72℃、30 sec,30 個循環;72℃,6 min。菌落PCR模版:在連接轉化產物長出菌克隆表面沾一下 ,溶于10 μ l LB,混勻取 1 μ l作為模板;PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳觀察。

(2)挑選陽性克隆送基因測序鑒定。

1.2.6 慢病毒的包裝及滴度測定

(1)慢病毒包裝細胞轉染:轉染前24 h,用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞,以含10%血清的培養基調整細胞密度為1.2×107細胞/20 ml,重新接種于15 cm細胞培養皿,37℃、5%CO2培養箱內培養。24 h待細胞密度達70%-80%時即可用于轉染。轉染前2 h將細胞培養基更換為無血清培養基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV 載 體 20 μ g,pHelper 1.0 載 體 15 μ g,pHelper2.0 載體 10 μ g),與相應體積的 Opti-MEM 混合均勻,調整總體積為2.5 ml,在室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻,取 100 μ l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 ml Opti-MEM混合,在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合。混合后,在室溫下溫育20 min,以便形成 DNA與 Lipofectamine 2000稀釋液的轉染復合物。將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉移至293T細胞的培養液中,混勻,于37℃,5%CO2細胞培養箱中培養。培養8 h后倒去含有轉染混和物的培養基,每瓶細胞加入20 ml的PBS液以洗滌殘余的轉染混和物,然后倒去。每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養基 25 ml,于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養48 h。

病毒的收獲及濃縮:收集轉染后48 h的293T細胞上清液。于4℃,4 000 g離心10 min,除去細胞碎片。過濾、濃縮。分裝后保存在病毒管中,-80度長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。

(2)慢病毒滴度測定逐孔稀釋法測定滴度:測定前一天,為293T細胞鋪板,96孔板,每個孔加4×104個細胞,體積為100 μ l。根據病毒的預期滴度,準備7-10個無菌的Ep管。在每個管中加入90 μ l的無血清培養基。取待測定的病毒原液10 μ l加入到第一個管中,混勻后,取10 μ l加入到第二個管中。繼續相同的操作直到最后一管。選取所需的細胞孔,吸去90 μ l培養基 ,丟棄。加入90 μ l稀釋好的病毒溶液。放入培養箱培養。24 h后,加入完全培養基100 μ l。4天后,觀察熒光表達情況。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而而減少。滴度計算:根據GFP熒光表達情況,病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數除以病毒原液量。

2 結果

2.1 人α-ASON重組慢病毒載體的鑒定結果

2.1.1 陽性克隆PCR鑒定

重組慢病毒載體構建成功后,轉化感受態細胞,挑選陽性克隆進行PCR鑒定。PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。PCR條帶大小:連接入vshRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為:343 bp(從載體中切掉24 bp);沒有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為:306 bp。

圖1 陽性克隆PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2 陽性克隆測序結果分析 陽性克隆送基因測序結果如圖2,與所需要的α-ASON序列完全一致。

2.2 人α-ASON重組慢病毒的滴度測定結果

在加入1×10-6μ l病毒原液的孔中觀察到5個帶有熒光的細胞,如圖3。說明該孔中至少有5個病毒顆粒感染了細胞,則該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數除以病毒原液量,就是5/(1×10-6)=5×106,單位為 TU/μ l,等于 5×109TU/ml。

3 討論

β-地中海貧血的主要病理基礎是由于α珠蛋白鏈的相對過剩,剩余的α珠蛋白鏈在紅細胞內形成包涵體,導致紅細胞膜的氧化損傷,造成紅細胞破壞及骨髓的無效造血[4]。國外研究者認為適當下調內源性α-珠蛋白基因表達,減少α-珠蛋白肽鏈合成可能比增加β-珠蛋白肽鏈生成更有助于改善β-地中海貧血患者癥狀[5]。劉容容等[2,3]設計并篩選出能高效抑制α珠蛋白基因表達的α-ASON,并證實該α-ASON能有效地抑制體外培養的重型β-地中海貧血紅系細胞α-珠蛋白基因表達,改善珠蛋白基因α/β+γ的比例失衡,使其紅系細胞內過剩α-珠蛋白肽鏈的沉積明顯減少。而α-ASON對于β-地中海貧血的體內試驗尚未見報道。基因治療載體系統是關系到基因治療成敗的重要因素之一。理想的載體應能有效的轉移一個或多個功能基因,并且具有特異的靶向性,不被免疫系統識別,可以穩定、方便的擴增,高濃度的大量純化,不會引起炎癥,對受體和環境安全,并能按適當的調控模式表達攜帶的外源基因[6]。慢病毒為反轉錄病毒的一個亞科,它既可以感染分裂細胞又可感染非分裂細胞,研究表明慢病毒載體還具有轉移的基因片段容量較大(9kb)、目的基因可整合至靶細胞基因組長期表達、免疫反應小等優點,且慢病毒載體對造血干細胞、免疫細胞等多種基因治療的重要靶向細胞都有極好的細胞嗜性,因此慢病毒是基因治療的較理想的載體;最為人們熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV),復制缺陷型HIV-1可被用于基因轉移,HIV-1具有簡單逆轉錄病毒的3個基因(gag、pol和env),此外還有6種輔助蛋白基因(tet、rev、vpr、nef和 vif)[6]。May等[7]在2000年首次報道用慢病毒載體對β-地中海貧血鼠模型進行基因治療。Chen等[8]的研究顯示,靜止的造血干細胞被慢病毒載體有效轉染,同時干細胞在體內自我更新和正常的種系特點不被損傷;用慢病毒載體有效的把基因導入到鼠干細胞,將使在諸如鐮狀細胞貧血和地中海貧血的血紅蛋白疾病鼠模型,能進行基因治療的直接試驗。此外,綠色熒光蛋白(GFP)作為報告基因具有觀察簡單方便和直觀的優點,只要有足夠的表達,可以直接進行活觀察,克服了其他報告基因需要底物及維持時間短的缺點[9,10]。

圖2 陽性克隆基因測序結果

圖3 人α-ASON重組慢病毒的滴度測定(加入 1×10-6μ l病毒原液)

實驗結果顯示,本實驗成功構建了報告基因GFP和α-ASON序列融合的慢病毒載體三質粒系統,通過脂質體轉染法將三質粒共轉染293T細胞,包裝產出病毒顆粒,并獲得了5×109TU/ml較高的病毒滴度。PCR鑒定正確,基因測序結果與所需要的α-ASON序列完全一致。實驗采用的慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎發展起來的基因治療載體,它可以在體內較長期的表達且安全性高,其為“自殺”性病毒,即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞,也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒。實驗采用的慢病毒載體系統由pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三質粒組成。pGC-LV載體中含有HIV的基本元件5′LTR和3′LTR以及其他輔助元件。通常根據不同的實驗目的針對pGC-LV載體改造以進行啟動子活性研究、基因表達研究、RNA干擾等研究。pHelper 1.0載體中含有HIV病毒的gag基因,編碼病毒主要的結構蛋白;pol基因,編碼病毒特異性的酶;rev基因,編碼調節gag和pol基因表達的調節因子。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因,提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。普通HIV-1載體借助其包膜表面的gpl20蛋白(由env基因編碼)只能感染CIM(+)T細胞,當用水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G或雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白取代HIV本身的包膜蛋白后,不僅進一步降低了HIV-1載體恢復成野生型病毒的可能同時由于VSV的包膜賦予HIV載體顆粒高度的穩定性,使其能夠通過超速離心濃縮而達到高滴度;更重要的一點是包膜替換擴大了HIV-1載體的嗜性范圍,使其幾乎能感染所有組織來源的細胞如神經元細胞、肝細胞、肌纖維細胞、視網膜細胞等[11-14]。

目前大多數研究者都使用瞬時轉染293T細胞的方式生產病毒載體。這種方法的缺點在于生產獲得的病毒載體可能會出現有缺陷的基因組。為了生產高質量的載體,必須篩選合適的包裝細胞系,而建立包裝細胞系的最大難點在于某些病毒蛋白具有細胞毒性。目前,為了建立合適的慢病毒載體包裝細胞系,許多科學家都在嘗試使用誘導型或可調節的啟動子來克服病毒蛋白的細胞毒作用[15,16]。本實驗采用脂質體轉染法將三質粒共轉染293T細胞,包裝病毒顆粒,效果較滿意。而慢病毒載體滴度可以參考腺病毒載體滴度的檢測方法[6],將病毒與293細胞共培養后,通過熒光顯微鏡觀察GPF熒光表達或流式細胞儀檢測GFP蛋白表達水平來分析病毒滴度。另外,還可以通過TaqMan PCR檢測細胞中病毒拷貝數的方法檢測滴度。由于熒光顯微鏡觀察GPF熒光表達具有方便、簡單和直觀的優點,本研究采用此方法來分析計算病毒滴度。經測定,本研究人α-ASON重組慢病毒的滴度達到了5×109TU/ml,且基因測序結果與所需要的α-ASON序列完全一致。因此,本研究成功構建了介導人α-ASON的慢病毒載體并包裝純化慢病毒顆粒,為α-ASON對β地中海貧血基因治療的體內試驗奠定了基礎。

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Construct recombinant lentiviral vectors carrying human α-antisense oligonucleotide

LAI Ying-hui,LAI Yong-rong,YANG Gao-hui.(Department of Hematology,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning530021,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vectors carrying human α-antisense oligonucleotide.MethodsAccording to the human α-antisense oligonucleotide sequence,pGCSIL-vshRNA-GFP plasmid was constructed by double restriction enzyme digestion and ligation,and then the plasmidwas transformed into E.coliDH5α.Purified pGCSIL-vshRNA-GFP plasmids from the positive clones was confirmed by PCR and sequencing.293T cells were cotransfected with lentiviral vector pGCSIL-vshR NA-GFP,pHelper 1.0 and pHelper 2.0 by Lipofectamine 2000 to produce lentivirus.The titer of virus was tested according to the expression level of green fluorescent protein.ResultsThe exogenous gene sequence of the recombinant plasmids was completely in accordance with that of the human α-antisense oligonucleotide.The titer of concentrated virus was 5×109TU/ml.ConclusionThe recombinant lentiviral vectors carrying humanα-antisense oligonucleotide are successfully constructed.

Lentiviral vector;Antisense oligonucleotide;Gene therapy

R392

A

1007-4287(2010)09-1358-05

國家自然科學基金資助項目(30860307),廣西研究生教育創新計劃資助項目

*通訊作者

2010-05-10)