鋅對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響

董 宇,劉衛(wèi)東,孫珉丹,李松鶴

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

鋅對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響

董 宇1,劉衛(wèi)東1,孫珉丹2,李松鶴1

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的研究金屬鋅對(duì)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響,證實(shí)鋅對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治作用。方法用Wistar大鼠建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型,隨機(jī)分成4組:正常對(duì)照組、正常補(bǔ)鋅組、高糖組、高糖+鋅組。3M后輕摘眼球,在視網(wǎng)膜切片上行VEGF免疫組化。結(jié)果正常對(duì)照組、正常+鋅組及高糖+鋅組視網(wǎng)膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽(yáng)性表達(dá),高糖組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫組化明顯陽(yáng)性表達(dá),高糖組視網(wǎng)膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常組、正常+鋅組及高糖+鋅組相比明顯增高(P＜0.001),正常組視網(wǎng)膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常+鋅組及高糖+鋅組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論我們認(rèn)為補(bǔ)充金屬鋅能減少糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變VEGF的表達(dá),有防治DR的作用。

糖尿病;視網(wǎng)膜病;金屬鋅;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1375)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是一種微血管病變,研究表明DR早期視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷,基底膜增厚,進(jìn)而引起管腔狹窄和血流改變,促進(jìn)DR后期發(fā)生視網(wǎng)膜缺血、缺氧和新生血管的形成[1]。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF已被公認(rèn)為DR新生血管生成的重要因子,因此我們通過對(duì)糖尿病大鼠補(bǔ)充金屬鋅治療,探討是否能減少視網(wǎng)膜組織VEGF的表達(dá),從而推測(cè)金屬鋅對(duì)DR的防治作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動(dòng)物模型的建立及分組

體重180-200 g的雄性Wistar大鼠50只,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于本實(shí)驗(yàn)。選取其中40只隨機(jī)分成4組:正常對(duì)照組(8只)、正常+鋅組(8只)、建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型高糖組(12只)、建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型高糖+鋅組(12只);正常+鋅組每日硫酸鋅15 mg/kg灌胃;高糖組腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg體重(新配制的0.1mol/L檸檬酸緩沖液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以誘發(fā)糖尿病,正常對(duì)照組和正常+鋅組僅注射同樣體積的檸檬酸緩沖液,注射STZ 3d后測(cè)尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及飲水明顯增多者列入糖尿病實(shí)驗(yàn)對(duì)象,實(shí)驗(yàn)期間大鼠正常飲食水,定期測(cè)血糖、尿糖及體重;高糖+鋅組每日硫酸鋅15 mg/kg灌胃并且腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg體重(新配制的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以誘發(fā)糖尿病,注射STZ 3 d后測(cè)尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及飲水明顯增多者列入糖尿病實(shí)驗(yàn)對(duì)象,實(shí)驗(yàn)期間大鼠正常飲食水,定期測(cè)血糖、尿糖及體重,實(shí)驗(yàn)期間大鼠正常飲食水,定期測(cè)血糖、尿糖及體重。3 M后各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物過量麻醉,輕摘眼球后處死大鼠。(除去中間死亡的大鼠及血糖恢復(fù)鼠,最后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),每組有6只列入統(tǒng)計(jì)對(duì)象)。

1.2 組織學(xué)處理

將眼球固定于10%中性福爾馬林中48 h,經(jīng)乙醇常規(guī)脫水,二甲苯透明后浸臘包埋。連續(xù)5 μ m厚切片用于免疫組化。

1.3 免疫組化染色步驟

免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(S-P法),其操作步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟、脫水。(2)PBS沖洗5 min。(3)3%H2O2-蒸餾水阻斷內(nèi)源性氧化物酶25 min。(4)PBS沖洗5 min,3次。(5)抗原修復(fù)。(6)山羊血清(1∶20)封閉30 min。(7)特異性一抗于切片上,孵育40 min。(8)PBS沖洗5 min,3次。(9)滴加相應(yīng)的二抗(IgG或Biotin),孵育40 min。(10)PBS沖洗5min,3次。(11)加相應(yīng)的三抗(S-A/HRP)孵育40 min。(12)PBS沖洗5 min,3次。(13)DAB-蒸餾水溶液顯色。(14)Mayer蘇木精復(fù)染,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.4 采用Imagepro-Plus軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)測(cè)定免疫組化視網(wǎng)膜組織累積光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。VEGF免疫組化IOD值各組含量采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組、正常+鋅組及高糖+鋅組視網(wǎng)膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽(yáng)性表達(dá)(見圖1、2、3)。

高糖組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫組化明顯陽(yáng)性表達(dá),在節(jié)細(xì)胞層尤其在內(nèi)核層陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。

圖1 正常組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫

圖2 正常+鋅組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫

圖3 高糖+鋅組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫

圖4 高糖組視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫

高糖組視網(wǎng)膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常組、正常+鋅組及高糖+鋅組相比明顯增高(P＜0.01),正常組視網(wǎng)膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常+鋅組及高糖+鋅組相比無(wú)顯著性差異,P＞0.05,見表 1。

3 討論

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一,它會(huì)造成具有特異性改變的眼底病變,以視網(wǎng)膜微血管的病理變化為特征,已經(jīng)成為雙眼盲的主要原因[2]。

表1 各組視網(wǎng)膜切片VEGF免疫組化IOD值

研究表明糖尿病患者視網(wǎng)膜缺血缺氧,導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)代償性增加,促進(jìn)了視網(wǎng)膜新生血管的形成及纖維增殖[3]。因此目前VEGF被公認(rèn)為促進(jìn)新生血管形成的最重要因子,是視網(wǎng)膜增殖性改變的啟動(dòng)因素[4,5]。另外DR發(fā)生導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和一定的AGEs受體結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo),使視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)視網(wǎng)膜VEGF分泌增多[6]。并且大量研究都表明糖尿病性視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激增加,氧自由基增多,氧化產(chǎn)物堆積,組織功能破壞[7,8]是DR發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激增加的來源包括自由基生成增多或者抗氧化防護(hù)組織破壞增加[9]。而金屬鋅是一種抗氧化劑,其廣泛存在于各種眼組織中,參與視黃醇還原酶及視黃醇結(jié)合蛋白的形成;鋅還有保護(hù)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞正常形態(tài)的功能,鋅缺乏則出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變,視細(xì)胞外段變性。低鋅還可使視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng),如SOD的活性降低,造成視覺細(xì)胞的過氧化損害[10]。有實(shí)驗(yàn)表明糖尿病患者體內(nèi)缺乏微量元素鋅,而且糖尿病有視網(wǎng)膜病變者比糖尿病無(wú)視網(wǎng)膜病變者更缺鋅。鋅的缺乏成為DR的危險(xiǎn)因素[11]。實(shí)驗(yàn)表明鋅對(duì)控制糖尿病大鼠高血糖和保護(hù)視網(wǎng)膜免遭氧化應(yīng)激的損害中有積極的效應(yīng)[12]。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)STZ糖尿病大鼠通過補(bǔ)鋅治療后視網(wǎng)膜石蠟切片VEGF免疫組化陽(yáng)性表達(dá)明顯低于STZ糖尿病大鼠組,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.001),正常對(duì)照組、正常+鋅組視網(wǎng)膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽(yáng)性表達(dá),但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。這一結(jié)果能證實(shí)鋅對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變VEGF過度表達(dá)具有抑制作用;并說明生理量補(bǔ)鋅不會(huì)影響視網(wǎng)膜VEGF正常表達(dá)。因此推測(cè)補(bǔ)鋅對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變具有防治作用。

[1]ChibberR,Ben-mahmud BM,Chibber S,et al.Leukocytes in diabetic retinopathy[J].CurrDiabetesRev,2007,3(1):3.

[2]Bunce C,Wormald R Leading causes of certification for blindness and partial sight in England Wales[J].B MC Public Health,2006,6:58.

[3]惠延年.眼科學(xué)[M].北京:人民出版社,2005:174-175.

[4]Mathews MK,Merges C,McLeod DS,et al.Vascular endothelial growth factor and vascular permeability changes in human diabetic retinopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1997,D,38(13):2729.

[5]Wirostko B M.Vascular endothelial growth factor[J].Ophthalmology,2007,114(10):1954.

[6]Goh SY,Cooper ME.Clinical review:The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2008,93(4):1143.

[7]Prasad AS,Bao B,Beck FW.Antioxidant effect of zinc in humans[J].Free Radic Biol Med,2004,15,37(8):1182.

[8]Moustafa SA.Zinc might protect oxidative changes in the retina and pancreas at the early stage of diabetic rats[J].Toxiol Appl Pharmacol,2004,201(2):149.

[9]Tate DJ,Newsome DA.A novel zinc compound(zinc monocysteine)enhances the antioxidant capacity of human retinal pigment epithelial cells[J].Curr Eye Res,2006,31(7-8):675.

[10]傅永懷.微量元素與臨床[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1997:217-218.

[11]聶景蓉,戴桂祥,曾夢(mèng)蘭,等.微量元素與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志,2006,29(3):27.

[12]Wang J,Song Y,Elsherif L,et al.Cardiac metallothionein induction plays the major role in the prevention of diabetic cardiomyopathy by zinc supplementation[J].Circulation,2006,113(4):544.

Effect of Zinc on Vascular Endothelial Growth Factor expression in Retinopathy of diabetic rats

DONGYu1,LIU Wei-dong1,SUN Min-dan2,et al.(1.Department ofOphthalmology,First ClinicalHospital of JilinUniversity,Changchun130021,China;2.Department of Nephrology,First Clinical hospital of Jilin University)

ObjectiveTo research preventative and therapeutic effects of zinc on vascular endothelial growth factor(VEGF)in retinopathy of diabetic rat.Methods40Wistar ratwere divided randomly into 4 groups,The normal control group、the normal with zinc group 、the diabetic retinopathy rat model group、the diabetic retinopathy rat model with zinc group.After 3 month,eyeballs were picked,and immunohistochemistry staining for VEGF were done on retinal paraffin slide.ResultsImmunohistochemistry staining for VEGF showed positive expressionin all group,The diabetic retinopathy rat modelgroupishigher thanother groups,whichhave significant difference(P＜0.001).The control group、the normal with zinc group and diabetic retinopathy rat model with zinc group do not have statistical difference(P＞0.05).ConclusionWe think the supplemen of zinc have inhibition effect on VEGF expression,the supplemen of zinc have preventative and therapeutic effects on diabetic retina rat.

Diabetes;Retina;Zinc;VEGF

R587.1

A

1007-4287(2010)09-1375-03

吉林省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究200905137

董宇,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事眼底病,眼外傷研究。

2009-11-27)