Hrad17在頭頸腫瘤中表達下降的研究

趙 明,陳 鷗,金春順,程鶴香,徐艷霞

(吉林大學第二醫院耳鼻咽喉科,吉林長春 130041)

Hrad17在頭頸腫瘤中表達下降的研究

趙 明,陳 鷗,金春順*,程鶴香,徐艷霞

(吉林大學第二醫院耳鼻咽喉科,吉林長春 130041)

目的DNA損傷修復基因在維持細胞穩定性的作用及頭頸腫瘤表現染色體不穩定性研究。方法應用基因表達芯片在7例頭頸腫瘤和6例正常口腔粘膜中篩查表達下調的基因,用實時定量RT-PCR證實基因芯片的結果,蛋白印跡檢測蛋白表達,定量PCR檢測其DNA拷貝數。結果Hrad17是發現下調的基因之一,Z-score和倍數變化分別為-2.5和0.39,定量RT-PCR顯示腫瘤組織中Hrad17 mRNA表達下降,均值為0.2166,而正常粘膜為0.3957(P＜0.05)。Western印跡顯示Hrad17蛋白在腫瘤組織中檢測不到(0/12),而在正常口腔粘膜組織中表達很強(6/7)。定量PCR顯示Hrad17DNA在大多數頭頸腫瘤組織中下降。結論Hrad17表達的缺失經常出現在頭頸鱗癌中,由于基因的缺失并可能導致頭頸鱗癌基因組的不穩定性,導致腫瘤發生。

頭頸腫瘤;Hrad17;染色體不穩定性

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1380)

細胞通過激活高度協調的DNA損傷反應系統以應答DNA損傷,DNA損傷和檢查點基因通過激活DNA修復途徑,使細胞周期停止和細胞凋亡幫助維持基因組的穩定性并防止腫瘤發生。大部分頭頸鱗狀細胞癌(HNSSC)的發生與長期接觸煙酒有關,這些外部DNA損傷劑可加速基因組改變,特別是在DNA修復功能受損的情況下。

近年研究發現哺乳動物細胞中,蛋白激酶ATM/ATR是DNA損傷應答通路關鍵成分,最早參與應答雙鏈DNA斷裂(DSBs),作為檢查點激酶級聯信號的起始激酶激活下游目標,而Hrad17正是這些關鍵激酶的底物。Hrad17與其他蛋白形成復合物在損傷的DNA部位形成夾子結構使ATM/ATR識別它們以全面激活DNA損傷反應。

Hrad17作為DNA損傷檢查點基因可能是一個潛在的腫瘤抑制基因,其功能的缺失或異常的表達可能參與腫瘤的發展。本實驗發現Hrad17表達下降和缺失,并且其DNA拷貝數下降或純和性缺失。因此,Hrad17在HNSSC中是失活的,在引起基因組不穩定性方面起重要作用從而導致HNSSC發生[1-6]。

1 材料與方法

1.1 基因鑒定 Affmetrix基因表達芯片(Affymetrix,Santa Clara,美國)被用于進行基因篩查。6個正常口腔黏膜和7個侵襲性頭頸腫瘤組織的cDNA與包含12000個基因的芯片雜交。用SNOMAD和SAM軟件進行分析,每個樣品的最終值Z-score表示,發現Hrad17是數據中的下調基因之一。

1.2 定量RT—PCR 用來自相同病人的mRNA樣品做實時定量RT-PCR以檢測Hrad17的表達水平。腫瘤位置包括咽(2/7),口腔(4/7),和喉(1/7)。腫瘤組織均在液氮速凍后在-80℃保存。引物和探針由Probe Express軟件(Applied Biosystems,美國)設計。The Hrad17正向引物是 5'-AGCGAGAAAAAGAGGAAATC-3',反向引物是 5'-TGCCTTTCTAAAACTTGAGC-3',由 Invitrogen公司合成。Taqman探針序列是5'-6FAM TCAGCATGAACTTGCTGTGCA TAMRA-3',由 Applied Biosystems(Foster City,美國)合成。β-actin正向引物序列是5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3',反向引物是5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3',探針是 5'-6FAM ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT TAMRA-3',應用一步反應法:50℃35分鐘合成cDNA,95℃變性5分鐘,PCR擴增95℃15秒,55℃1分鐘,共45個循環。RT-PCR是用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統。每個樣品重復3次。

1.3 Western blot分析 從12個冰凍的頭頸腫瘤組織和7個正常上皮組織中提取蛋白,檢測Hrad17的蛋白表達。腫瘤部位包括咽(3/12),喉(3/12)和口腔(6/12)。腫瘤組織保存方法同上。從上述樣本中用TRIzol分離沉淀了DNA和RNA后,從苯酚-酒精上清液中提取蛋白。每個蛋白樣品取50 mg置于10%SDS-PAGE膠中,并在120v下電泳90 min,蛋白條帶在50v被轉到PROTRAN膜上1 h,該膜在5%的脫脂奶中室溫下搖晃阻滯1 h,在膜上覆蓋1∶500稀釋的鼠抗人Hrad17單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,美國)4℃過夜,然后與辣根過氧化物標記的馬抗鼠IgG(Amersham Biosciences,英國)室溫下孵育1 h,抗體結合物室溫下結合化學發光物(Amersham Biosciences,英國),然后在X線片上曝光可見。然后PBS洗掉印記,加鼠抗人β-actin抗體1∶3 000稀釋,檢測方法同前。

1.4 定量PCR 隨機選取Hrad17內含子序列并設計正向和反向引物(5'-CCAAATTGGGTAGAAGGTACA-3',和 5'-AACGGGAGAAGGCTATGC-3')和Taqman 探針(5'-6FAM TACCTCATATCCCCTGCCCCAACACA TAMRA-3')用實時定量PCR檢測DNA的拷貝數。同時設計了一套GAPDH的引物和探針以標準化Hrad17的拷貝數。(正向引物5'-GGCCGCCATGTTGCAA-3',反向引物 5'-CAGGAGCGCAGGGTT AGTCA-3',Taqman探針(5'-6FAMATGAATGGGCAGCCGTT AGGAAAGCC TAMRA-3')。DNA樣品均來自經顯微切除的腫瘤組織和配對的正常的外周血淋巴細胞DNA。PCR擴增95℃2分鐘,然后95℃15 s,60℃1 min,共50個循環。所有的定量 PCR均用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems,美國)完成。每個樣品重復3次。

2 結果

2.1 基因表達芯片 用HU95A.V2基因芯片,在7個原發頭頸腫瘤組織,6個正常組織的cDNA中篩查了超過12000個基因,SNOMAD和SAM軟件用來做統計分析。結果顯示與正常的上皮組織相比很多基因在頭頸腫瘤組織中表達下降,包括DNA損傷檢查點基因和修復基因,其中下降明顯的有Hrad17,在頭頸腫瘤組織中,它的 Z-score和倍數變化分別是-2.5和0.39。圖1中正常粘膜除一例外均大于1,而腫瘤組織除2例均小于1,而其中P2291的值僅為0.04,可以考慮為0,數據顯示腫瘤組織的表達大部分為下降。

2.2 定量RT-PCR檢測Hrad17mRNA表達 采用相同的標本行RT-PCR以驗證基因芯片的結果,Hrad17的 mRNA表達結果用β-actin來標準化。Hrad17與β-actin的表達比率作為相對定量Hrad17的mRNA表達。這個結果與基因芯片的結果一致,正常上皮組織中的Hrad17的表達高于頭頸腫瘤組織,中位數分別為0.396和0.2166,圖2腫瘤組中的表達結果明顯低于正常組,大約是正常組的一半。

2.3 Western blot印跡檢測Hrad17蛋白表達 為了進一步檢測蛋白表達水平,選擇了12個頭頸腫瘤和7個正常咽喉粘膜標本。圖3蛋白印跡的結果顯示所有腫瘤組織檢測不到或只能檢測到非常弱的條帶。而所有正常組織(除了N2805)均檢測到很強的條帶,值得注意的是,這個沒有檢測到Hrad17的樣本的β-actin表達也非常弱。

2.4 定量PCR檢測Hrad17拷貝數 為了進一步探討頭頸腫瘤hrad17表達下降的原因,選擇 9個Hrad17蛋白低表達的腫瘤標本,隨機選取一段內含子行定量PCR擴增,檢測9個腫瘤樣本和配對的正常DNA拷貝數,所有樣本均用GAPDH標準化。Hrad17與GAPDH擴增量的比率被認為是Hrad17的相對定量DNA拷貝數。圖4所示為在經正常配對的外周血DNA標準化之后的Hrad17DNA拷貝數,比率是1,說明正常和腫瘤有相同的Hrad17拷貝數,9例中有7個(78%)顯示Hrad17拷貝數小于1,只有2例顯示比率高于1(1.46和1.27)提示可能獲得的Hrad17的拷貝數。腫瘤樣本DNA拷貝數的中位值是0.55,說明大部分腫瘤組織丟失了近一半的Hrad17 DNA拷貝數。4例樣本Hrad17的比率低于0.5,其中一例是0.15,因此,說明Hrad17的雜合性缺失與其表達降低相關,至少1例顯示Hrad17拷貝數與純合性缺失有關。

圖1 頭頸腫瘤和正常上皮粘膜Hrad17基因表達芯片的結果

圖2 定量RT-PCR二者的Hrad17mRNA表達結果比較

圖3 Western blot兩組的Hrad17蛋白表達結果的比較

圖4 定量PCR頭頸腫瘤的DNA拷貝數

3 討論

機體通過誘導細胞周期停止以應答DNA損傷從而保持基因組的穩定。有缺陷的細胞周期檢查點和受損的DNA修復途徑可以導致基因組不穩定性,并導致正常細胞的惡性轉化到癌細胞。癌細胞具有的明顯的基因組不穩定性反映了細胞周期檢查點或DNA修復能力的缺陷并導致基因突變積累是重要的致癌因素。細胞周期檢查點應答DNA損傷的活性是維持基因組穩定性和腫瘤抑制的要素。

人Hrad17作為S.pombe rad17檢查點基因的同源物被鑒定出來。雖然Hrad17的作用還不完全清楚,它在酵母檢查點蛋白的同源物提示它在細胞周期調控中起作用。ATM/ATR作為應答DNA雙鏈損傷(DSBs)的感受器被激活,啟動一系列磷酸化級聯反應,使Hrad17被ATM/ATR磷酸化并結合于染色體,募集檢查點蛋白復合物在DNA受損部位以修復損傷,Hrad17磷酸化對于DNA損傷誘導的G2期停止是必需的,從而使細胞進入有絲分裂之前有充足的時間來修復系統糾正錯誤,避免它們被傳到下一代[1-5,11]。

本研究應用定量RT-PCR顯示與正常上皮組織相比Hrad17在原發頭頸腫瘤組織中下調,而且頭頸腫瘤的mRNA表達水平幾乎是正常上皮細胞的一半。值得注意的是,用于分析的樣本雖然經過顯微切除,腫瘤組織仍可包含多達30%的正常間質細胞。可以推斷腫瘤組織中的實際mRNA水平低于實際所觀察到的。進一步的頭頸腫瘤組織的蛋白表達分析顯示Hrad17蛋白水平是觀察不到或缺失的,而正常組織顯示了強表達。

Hrad17是位于染色體5q12-13.1,在頭頸腫瘤和其他類型腫瘤這個位點經常表現為缺失,提示有腫瘤抑制基因存在于這個染色體臂上。

應用定量PCR檢測Hrad17隨機的內含子序列相對于看家基因的擴增量以判斷Hrad17拷貝數。Hrad17DNA拷貝數的大部分低于1,中位數是0.55,拷貝數是低于0.2的腫瘤樣本可能是Hrad17純合性缺失。

綜上所述,這些數據表明Hrad17在原發頭頸鱗狀細胞癌是失活的,雖然本研究的數據說明在小部分腫瘤中顯示純合性缺失,這些機制尚不足以解釋所觀察到的腫瘤組織的蛋白表達缺失,可能同時還有其他的失活機制,包括翻譯后機制和導致蛋白降解的機制等,還有啟動子甲基化可能導致轉錄沉默。

Hrad17序列的改變也在其他腫瘤細胞系中發現,比如:結腸癌,視網膜母細胞瘤細胞系和肺癌細胞系。突變也可能導致Hrad17表達缺失。

雖然本文顯示在頭頸腫瘤中Hrad17表達缺失或下降,在睪丸腫瘤中也有同樣報道。有些報道顯示Hrad17在肺,結腸和乳腺癌中過表達,可能是由于誘導產生Hrad17以應答在實體瘤中經常發生的DNA損傷。頭頸腫瘤是已知顯示了嚴重的染色體不穩定性的表型,并且Hrad17表達的缺乏將直接的導致這個表型的發展[6-11]。

作為DNA損傷檢查點基因,Hrad17被磷酸化對于啟動DNA損傷的檢查點反應是必需的[1-3,11]。因此,Hrad17可能參與DNA修復合成和介導細胞周期調節。Hrad17缺乏會危害對損傷的DNA起相應反應的檢查點途徑。細胞缺乏Hrad17基因不但導致積累DSBs,也使細胞染色體以高速率復制,因此我們強調Hrad17在阻止癌細胞中經常出現的染色體畸變的重要性。這個途徑的障礙可能構成癌癥發生的一個關鍵的轉折點,檢查點基因的突變或缺失將產生更多突變,導致基因組不穩定性。結合上述數據,Hrad17基因表達缺失可能是導致頭頸腫瘤基因組不穩定性的因素。

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Study on Decrease in Hrad17 Expression in Head and Neck Squamous Carcinoma

ZHAO Ming,CHEN Ou,JIN Chun-shun,et al.(The Second Hospital of JilinUniversity,Dept.of Otolaryngology,Jilin Changchun130041,China)

ObjectiveDNA repair genes play a critical role in maintaining gene stability.Significance of head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)shows chromosomal instability.MethodsMicroarrays was applied to 7 samples of primary HNSCC and 6 samples of normal control oral epithelial tissue.Additional confirmationwas performed by quantitative RT-PCR in these samples and followed by western blot,quantitative PCR at the Hrad17 locus.ResultsHrad17wasone of the downregulated checkpoint genes in primary head and neck tumor tissue.Its Z-score and fold changewere-2.5 and 0.39,respectively.The resultsof normalized,quantitative RT-PCR showed decreasedexpression of Hrad17mR NA in tumor tissue(mean value 0.2166)when comparedwith normal tissue(mean value 0.3957,p＜0.05).Western blot demonstrated undetectable expression of Hrad17 protein in primary tumor tissue(0/12),while there was strong expression of Hrad17 protein in normal oral mucosal tissue(6/7).Quantitative PCR showed that Hrad17 DNA copy number was decreased in the majority of head andneck tumor tissue samples.ConclusionLoss of Hrad17 expression occurs frequently in HNSCC,is often due to genomic deletion,andmay facilitate genomic instability in HNSCC and carcinogenesis.

head and neck cancer;Hrad17;chromosomal instability

R739.91

A

1007-4287(2010)09-1380-04

本課題為長春市科技局資助項目(2008117)

*通訊作者

2010-04-29)